無細胞蛋白表達

來源: 發(fā)布時間:2025-07-09

無細胞蛋白表達技術(shù)的模板可以是線性DNA(如PCR產(chǎn)物)或環(huán)狀質(zhì)粒,需包含啟動子(如T7/T3/SP6)和核糖體結(jié)合位點(RBS)以啟動轉(zhuǎn)錄翻譯。為提升效率,系統(tǒng)可能添加分子伴侶(如DnaK/GroEL)輔助蛋白折疊,或氧化還原劑(如谷胱甘肽)促進二硫鍵形成。部分高級系統(tǒng)(如PURE體系)使用純化重組元件替代粗提物,實現(xiàn)更高可控性,但成本較高。無細胞蛋白表達技術(shù)可靈活引入非天然氨基酸(nnAA),擴展了蛋白質(zhì)的功能多樣性。例如,通過定制tRNA和氨酰-tRNA合成酶,無細胞蛋白表達技術(shù)系統(tǒng)能準確將熒光標記或交聯(lián)基團嵌入目標蛋白,用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)或藥物偶聯(lián)開發(fā)。更前沿的應(yīng)用是人工生命體系的構(gòu)建,如利用無細胞蛋白表達技術(shù)合成噬菌體或人工細胞雛形,結(jié)合微流控技術(shù)模擬細胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò),為合成生物學(xué)研究提供可控的簡化模型。大腸桿菌體外蛋白表達??的成本只為兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)的1/20,適合大規(guī)模篩選。無細胞蛋白表達

無細胞蛋白表達,蛋白表達

體外蛋白表達已成為生物學(xué)教學(xué)的高效工具。高中生使用 “GFP 熒光蛋白表達試劑盒”(含凍干裂解物和 pET-28a-GFP 質(zhì)粒),加水混合后在 37℃ 培養(yǎng)箱放置 2 小時,紫外燈下即可觀察到綠色熒光,直觀演示“基因→蛋白→功能”的中心法則。美國 Bio-Rad 公司推出的教育套件年銷量超 10 萬套,實驗成功率 >95%。在合成生物學(xué)領(lǐng)域,該技術(shù)助力學(xué)生設(shè)計 人工生物回路:如將乳糖操縱子序列與紅色熒光蛋白基因融合,添加 IPTG 后 3 小時啟動表達,通過熒光強度量化啟動子活性。這種 “當(dāng)日設(shè)計,當(dāng)日驗證” 的模式,極大加速了生命科學(xué)創(chuàng)新人才的培養(yǎng)進程。常用蛋白表達水平我們需要先??構(gòu)建蛋白表達載體??,再轉(zhuǎn)染細胞。

無細胞蛋白表達,蛋白表達

盡管體外蛋白表達在科研領(lǐng)域優(yōu)勢明顯,其規(guī)?;瘧?yīng)用仍面臨三重挑戰(zhàn):裂解物制備成本高: 真核裂解物(如兔網(wǎng)織紅細胞)的原料獲取與標準化生產(chǎn)難度大,單位成本遠超微生物發(fā)酵;反應(yīng)體系穩(wěn)定性不足: 蛋白酶/核酸酶導(dǎo)致的產(chǎn)物降解及底物(如ATP)快速耗竭限制持續(xù)合成時間;產(chǎn)物濃度天花板: 當(dāng)前比較好工藝的蛋白產(chǎn)量約5g/L,較CHO細胞系統(tǒng)(>10g/L)存在差距。解決這些瓶頸需開發(fā) 工程化裂解物(如RNase缺陷型菌株)與連續(xù)流灌注技術(shù),提升經(jīng)濟可行性

無細胞蛋白表達技術(shù)(CFPS)在毒性蛋白和膜蛋白的合成中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。傳統(tǒng)細胞系統(tǒng)難以表達具有細胞毒性的蛋白(如溶菌酶、限制性內(nèi)切酶),而無細胞蛋白表達技術(shù)通過體外開放環(huán)境規(guī)避了宿主細胞存活限制,可高效合成活性毒蛋白,例如珀羅汀生物成功表達的BamHI內(nèi)切酶,其Minimun活性濃度只需0.001μg/μL。此外,無細胞蛋白表達技術(shù)通過添加表面活性劑或脂質(zhì)體模擬膜環(huán)境,實現(xiàn)了全長跨膜蛋白(如CLDN18.1)的可溶表達,純度達80%以上,為藥物靶點開發(fā)提供了關(guān)鍵工具。芯片級體外蛋白表達??體現(xiàn)較前沿的進展。

無細胞蛋白表達,蛋白表達

從裂解物來源看,無細胞蛋白表達技術(shù)主要分為原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)。原核系統(tǒng)以大腸桿菌S30提取物為主,成本低、耐受性強,適合表達簡單蛋白或引入非天然氨基酸,但缺乏復(fù)雜翻譯后修飾能力。真核系統(tǒng)包括兔網(wǎng)織紅細胞裂解物(RRL)和麥胚提取物(WGE),前者適合哺乳動物蛋白的高效表達,后者對植物和病毒蛋白更優(yōu),且能處理長鏈RNA,但成本較高。此外,昆蟲細胞提取物系統(tǒng)近年也用于復(fù)雜蛋白的修飾研究。英國nuclera 高通量微流控蛋白表達篩選系統(tǒng)可助力支持無細胞蛋白表達技術(shù),如想了解更多信息,歡迎咨詢官方代理商上海曼博生物!兔網(wǎng)織紅細胞裂解物??含??成熟血紅蛋白合成機制??,能實現(xiàn)復(fù)雜酶活性分子的功能性蛋白表達。高通量蛋白表達注意事項

用微流控技術(shù)整合裂解物分配\DNA模板加載及反應(yīng)監(jiān)測模塊可在??單張芯片上并行執(zhí)行千次蛋白表達反應(yīng)??.無細胞蛋白表達

從實驗室走向產(chǎn)業(yè)化,無細胞蛋白表達技術(shù)還面臨多重障礙。規(guī)?;a(chǎn)時,反應(yīng)體系的均一性和重復(fù)性難以保證,且大規(guī)模制備高活性裂解物的成本效益比仍需優(yōu)化。在下游純化環(huán)節(jié),由于反應(yīng)混合物中含有大量核酸、酶和其他細胞組分,目標蛋白的分離純化步驟比傳統(tǒng)方法更復(fù)雜。此外,目前大多數(shù)CFPS工藝仍處于分批反應(yīng)模式,連續(xù)化生產(chǎn)設(shè)備的開發(fā)滯后,限制了其在工業(yè)流水線中的應(yīng)用潛力。盡管存在這些挑戰(zhàn),隨著微流控技術(shù)、人工智能優(yōu)化反應(yīng)條件等新方法的引入,CFPS技術(shù)正在逐步突破這些產(chǎn)業(yè)化瓶頸。無細胞蛋白表達