北京醫(yī)療器械熱原檢測流程

MAT法熱原檢測出現(xiàn) “無信號(hào)”，需從試劑、實(shí)驗(yàn)操作、儀器三方面定位原因并解決。試劑層面，抗體不足或失活會(huì)導(dǎo)致無法捕獲 IL-6，需核對抗體稀釋比例，檢查保存條件（如 2-8℃）與有效期，必要時(shí)更換試劑；底物失效（如變色、沉淀）會(huì)無法顯色，需觀察底物外觀，失效則更換；混合不同試劑盒試劑會(huì)因成分不匹配導(dǎo)致反應(yīng)失敗，需使用同試劑盒試劑；ELISA 試劑盒保存不當(dāng)（如反復(fù)凍融）會(huì)破壞試劑活性，需按說明書分條件保存（如抗體 2-8℃、底物避光）。實(shí)驗(yàn)操作中，孵育溫度過低（<37℃）會(huì)抑制酶促反應(yīng)，需提前將試劑與孔板平衡至室溫，確保孵育溫度達(dá)標(biāo)；洗板機(jī)壓力過高或手動(dòng)洗滌過猛，會(huì)洗去結(jié)合的抗體與酶，需調(diào)整洗板機(jī)壓力或輕柔手動(dòng)洗滌；孵育時(shí)孔板未密封導(dǎo)致孔變干，會(huì)使反應(yīng)體系破壞，需用封口膜密封孔板。儀器方面，洗板機(jī)噴頭堵塞會(huì)導(dǎo)致洗滌不均或未洗，需清理噴頭；酶標(biāo)儀波長設(shè)置錯(cuò)誤（未選 450nm）會(huì)無法檢測信號(hào)，需確認(rèn)波長設(shè)置正確。

熱原是能引發(fā)恒溫動(dòng)物體溫異常升高的物質(zhì)總稱，主要成分為細(xì)菌內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS），同時(shí)涵蓋病毒、真菌毒素、支原體等非內(nèi)毒素?zé)嵩?，其檢測是保障藥品與醫(yī)療器械安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)前熱原檢測已形成 “特異性檢測 + 廣譜篩查” 互補(bǔ)的完整體系：以鱟試驗(yàn)法（含天然 LAL 與重組 rCR/rFC 試劑）作為細(xì)菌內(nèi)毒素的特異性檢測手段，憑借 fg 級靈敏度成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法，可通過凝膠法實(shí)現(xiàn)定性、動(dòng)態(tài)濁度 / 顯色法完成定量；以家兔熱原試驗(yàn)作為傳統(tǒng)廣譜篩查方法，雖操作繁瑣（需預(yù)試篩選基礎(chǔ)體溫穩(wěn)定家兔，正式試驗(yàn)觀察 3 小時(shí)體溫變化），但仍是放射性質(zhì)的藥物、血液制品等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品排除非內(nèi)毒素?zé)嵩难a(bǔ)充手段；以單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）作為新興全熱原檢測技術(shù)，利用人源單核細(xì)胞（如 THP-1 細(xì)胞）釋放 IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子的特性，可同時(shí)識(shí)別內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?，契合疫苗、基因治療產(chǎn)品等對風(fēng)險(xiǎn)控制的需求。三種方法協(xié)同應(yīng)用，從原料入廠到成品放行構(gòu)建全流程熱原防控網(wǎng)絡(luò)，既保證對內(nèi)毒素的準(zhǔn)確監(jiān)控，又避免非內(nèi)毒素?zé)嵩倪z漏風(fēng)險(xiǎn)。

MAT法熱原檢測中，獲得標(biāo)準(zhǔn) S 型標(biāo)曲需通過顯色時(shí)機(jī)控制與圖形調(diào)整實(shí)現(xiàn)，確保標(biāo)曲擬合準(zhǔn)確。在顯色時(shí)機(jī)控制上，加入 TMB 底物后，孔內(nèi)顏色會(huì)逐漸變藍(lán)，且隨反應(yīng)時(shí)間加深，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度呈現(xiàn)明顯藍(lán)色差異（如高濃度孔深藍(lán)色、低濃度孔淺藍(lán)色）時(shí)，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長，可在終止前檢測高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD600nm 值，當(dāng)達(dá)到 1.0 左右時(shí)終止，此時(shí)顯色反應(yīng)處于線性期，終止后顏色由藍(lán)變黃，信號(hào)強(qiáng)度約增強(qiáng) 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調(diào)整上，若標(biāo)曲擬合后未呈現(xiàn)明顯 S 型，可通過調(diào)整坐標(biāo)軸范圍優(yōu)化—如將縱軸（OD 值）范圍設(shè)為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設(shè)為對數(shù)坐標(biāo)，突出低濃度區(qū)的拐點(diǎn)與高濃度區(qū)的平臺(tái)區(qū)，使曲線更接近 S 型。此外，標(biāo)曲配制需確保濃度點(diǎn)單獨(dú)配制（非連續(xù)稀釋），避免高濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染低濃度點(diǎn)，導(dǎo)致低濃度區(qū)信號(hào)異常升高，破壞 S 型曲線形態(tài)。通過以上方法，可有效提升 S 型標(biāo)曲的成功率，保障熱原定量的準(zhǔn)確性。

在單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）的熱原檢測中，IL-6 被確定為關(guān)鍵檢測指標(biāo)，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在穩(wěn)定性、生物學(xué)關(guān)聯(lián)性及商業(yè)化應(yīng)用上的優(yōu)勢。從穩(wěn)定性來看，IL-6 在體外培養(yǎng)環(huán)境中受個(gè)體免疫狀態(tài)影響較小，半衰期更長，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更優(yōu)，且檢測靈敏度高，能準(zhǔn)確定量熱原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 產(chǎn)生時(shí)間短、表達(dá)量低，還易被蛋白酶降解，導(dǎo)致檢測信號(hào)波動(dòng)大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。從生物學(xué)特性而言，IL-6 是先天免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可通過活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驅(qū)動(dòng)急性期反應(yīng)，如誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生前列腺素 E2（PGE2）觸發(fā)發(fā)熱，與熱原的致熱機(jī)制直接關(guān)聯(lián)，是公認(rèn)的發(fā)熱標(biāo)志物。同時(shí)，MAT 法熱原檢測會(huì)輔以 IL-1β 和 TNF-α 監(jiān)測 ——IL-1β 反映單核細(xì)胞活化程度，TNF-α 提示炎癥放大效應(yīng)，形成多因子協(xié)同體系。此外，IL-6 的 ELISA 試劑盒市場成熟度高、跨平臺(tái)兼容性強(qiáng)，而 IL-1β 和 TNF-α 的檢測方法在靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化上仍有局限，進(jìn)一步奠定了 IL-6 的重要地位。

家兔熱原試驗(yàn)作為熱原檢測領(lǐng)域的 “法定傳統(tǒng)方法”，被中國藥典（ChP）、美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測項(xiàng)目，其主要優(yōu)勢在于可通過家兔體溫應(yīng)答篩查所有類型熱原，尤其適用于無法排除非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜母唢L(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，如血液制品、放射性質(zhì)藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗(yàn)存在明顯局限：動(dòng)物個(gè)體差異大，需額外投入時(shí)間與成本篩選合格家兔；檢測周期長（至少 6 小時(shí)），無法滿足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對 LPS 檢測限≥5EU/kg），與全球倡導(dǎo)的“動(dòng)物福利3R原則”背道而馳。

革蘭氏陽性菌注射劑產(chǎn)品只依賴內(nèi)毒素檢測存在安全風(fēng)險(xiǎn)，需結(jié)合熱原檢測特性制定防控方案。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，而革蘭氏陽性菌可產(chǎn)生非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EPs），如脂磷壁酸，這類物質(zhì)同樣能引發(fā)人體發(fā)熱反應(yīng)，若只檢測內(nèi)毒素，可能遺漏 NEPs 污染，導(dǎo)致臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)。對此，風(fēng)險(xiǎn)評估需重點(diǎn)關(guān)注三點(diǎn)：一是建議開展家兔法與內(nèi)毒素檢測的一致性實(shí)驗(yàn)，對比兩種方法的檢測結(jié)果，排查是否存在內(nèi)毒素未檢出但家兔法陽性的情況；二是采用 MAT 法熱原檢測，其通過單核細(xì)胞活化機(jī)制，可同時(shí)識(shí)別內(nèi)毒素與 NEPs，若 MAT 法檢測陽性，需進(jìn)一步追溯 NEPs 來源；三是若無法排除 NEPs 風(fēng)險(xiǎn)，必須按藥典要求補(bǔ)充熱原檢測（如 MAT 法或家兔法），而非只依賴內(nèi)毒素檢測。尤其對于新藥或工藝變更后的產(chǎn)品，需通過多方法驗(yàn)證，確保熱原檢測覆蓋所有潛在致熱物質(zhì)，保障臨床用藥安全。