浙江合規(guī)性內(nèi)毒素檢測(cè)動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑

內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑的反應(yīng)受pH的干擾。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，要調(diào)節(jié)被測(cè)溶液的pH值，使鱟試劑與供試品溶液的混合溶液pH值落在鱟試劑指定的使用pH范圍內(nèi)（一般鱟試劑作用pH值在6.0~8.0范圍內(nèi))。用于調(diào)節(jié)pH值的試液或溶液（酸或堿)，可采用BET用水配制，并將溶液在無(wú)熱原容器中儲(chǔ)存；必須對(duì)試液或溶液進(jìn)行驗(yàn)證，以證明不含可檢出的內(nèi)毒素并且無(wú)干擾因素。調(diào)節(jié)pH試劑（酸或堿）的添加量，不應(yīng)該超過(guò)供試品的1092。如果超過(guò)10%，則在進(jìn)行計(jì)算時(shí)，將DH試劑的添加量的系數(shù)計(jì)算進(jìn)去。

在進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，干擾試驗(yàn)又叫增強(qiáng)或抑制試驗(yàn)，主要目的是確證檢測(cè)內(nèi)毒素的方法是否受樣品干擾。在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法中，驗(yàn)證試驗(yàn)前，要去除樣品可能含有的內(nèi)毒素，以確保建立方法的準(zhǔn)確可靠。藥典規(guī)定：①當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，需進(jìn)行干擾試驗(yàn)；②當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變，或試驗(yàn)環(huán)境下發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，需重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。生產(chǎn)廠家常發(fā)生的一些微小變更，會(huì)影響到評(píng)估結(jié)果，進(jìn)而影響到供試品對(duì)鱟試劑的干擾試驗(yàn)。因此，生產(chǎn)廠家應(yīng)制定一個(gè)重復(fù)進(jìn)行干擾試驗(yàn)的周期，并進(jìn)行跟蹤和記錄。

在內(nèi)毒素檢測(cè)的技術(shù)體系中，凝膠法與動(dòng)態(tài)顯色法基于不同原理與特性，形成互補(bǔ)應(yīng)用格局。凝膠法依托鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)定性或半定量檢測(cè)，其靈敏度覆蓋 0.03EU/ml、0.06EU/ml 等多梯度，60 分鐘即可完成反應(yīng)；檢測(cè)結(jié)果依賴肉眼觀察（180° 倒轉(zhuǎn)判讀凝膠形成），數(shù)據(jù)需手工記錄，配套 內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀（恒溫儀） 即可開(kāi)展，雖自動(dòng)化程度有限，但操作簡(jiǎn)潔，適用于生產(chǎn)環(huán)節(jié)的快速初篩。與之相比，動(dòng)態(tài)顯色法通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)混合物吸光度或透光率的變化（如達(dá)預(yù)設(shè)檢測(cè)值的反應(yīng)時(shí)間、信號(hào)增速）實(shí)現(xiàn) 定量檢測(cè) ，靈敏度拓展至 5-0.005EU/ml ，60-90 分鐘反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)雖略長(zhǎng)，卻可借助酶標(biāo)儀或全自動(dòng)內(nèi)毒素檢測(cè)分析儀完成全流程自動(dòng)化操作—軟件實(shí)時(shí)采集數(shù)據(jù)，契合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）對(duì)數(shù)據(jù)追溯與精度的要求。二者各有側(cè)重：凝膠法以 “快速定性” 服務(wù)基礎(chǔ)防控，動(dòng)態(tài)顯色法憑 “準(zhǔn)確定量 + 自動(dòng)化” 支撐嚴(yán)苛質(zhì)控，共同為內(nèi)毒素檢測(cè)提供靈活適配的技術(shù)路徑。

湖州申科針對(duì) LER 提供多平臺(tái)內(nèi)毒素檢測(cè)解決方案，適配不同成因的 LER 問(wèn)題：一是鱟試劑配套增強(qiáng)劑，通過(guò)添加分散劑、過(guò)量二價(jià)陽(yáng)離子，改善 LPS 聚集體狀態(tài)，提升回收率；二是重組鱟試劑（rCR），無(wú) G 因子干擾，完全模擬天然鱟級(jí)聯(lián)反應(yīng)，靈敏度達(dá) 0.005EU/mL，易與天然方法橋接；三是重組 C 因子（rFC），靈敏度 0.005-5EU/mL，性狀穩(wěn)定，適配特定基質(zhì)；四是 單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定（MAT)法，通過(guò)檢測(cè) IL-6 覆蓋全熱原，不受 LPS 結(jié)構(gòu)變化影響；五是質(zhì)譜技術(shù)，驗(yàn)證基質(zhì)殘留對(duì)檢測(cè)的干擾。多平臺(tái)協(xié)同確保內(nèi)毒素檢測(cè)準(zhǔn)確可靠。

內(nèi)毒素檢測(cè)中，樣品中的蛋白質(zhì)或酶的修飾作用易破壞鱟試劑的反應(yīng)體系，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果失真。鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素的本質(zhì)是一系列絲氨酸蛋白酶的酶促放大過(guò)程，若樣品中存在氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑或?qū)Ｒ皇Щ顒瑫?huì)直接滅活反應(yīng)所需的酶；而乙醇、苯酚等物質(zhì)則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，同樣抑制反應(yīng)進(jìn)程。例如，某些生物制品中含有的蛋白水解酶，可能提前降解鱟試劑中的蛋白酶，使內(nèi)毒素?zé)o法被正常檢測(cè)。為消除這類干擾，需優(yōu)先限制樣品中抑制物的含量：可采用內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品，降低抑制物濃度；對(duì)耐熱的抑制物（如部分蛋白水解酶），可通過(guò)加熱滅活處理（如 56℃孵育 30 分鐘）破壞其活性；若樣品基質(zhì)復(fù)雜，還可使用超濾技術(shù)分離內(nèi)毒素與干擾蛋白質(zhì)，避免修飾作用對(duì)酶促反應(yīng)的影響，保障內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）通過(guò)完整模擬天然鱟試劑的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑，實(shí)現(xiàn)高效且特異的內(nèi)毒素檢測(cè)。其反應(yīng)機(jī)制為：內(nèi)毒素首先活化重組 C 因子，活化的 C 因子進(jìn)一步活化重組 B 因子，隨后活化重組凝固酶原轉(zhuǎn)化為凝固酶，再催化顯色底物產(chǎn)生黃色信號(hào)（405nm 波長(zhǎng)可檢測(cè)）。這一級(jí)聯(lián)放大過(guò)程有效提升了檢測(cè)靈敏度，即使微量?jī)?nèi)毒素也能產(chǎn)生可識(shí)別信號(hào)。與單因子的重組 C 因子法（rFC）相比，rCR 的多因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)抗干擾能力更強(qiáng)，尤其對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品（如高蛋白單抗、疫苗）表現(xiàn)更優(yōu)。同時(shí)，rCR 剔除了天然鱟試劑中的 G 因子，避免了與 β-D 葡聚糖的非特異性反應(yīng)，從根本上減少假陽(yáng)性結(jié)果，保障檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性。