北京血液制品熱原檢測(cè)規(guī)范

MAT法熱原檢測(cè)中，獲得標(biāo)準(zhǔn) S 型標(biāo)曲需通過顯色時(shí)機(jī)控制與圖形調(diào)整實(shí)現(xiàn)，確保標(biāo)曲擬合準(zhǔn)確。在顯色時(shí)機(jī)控制上，加入 TMB 底物后，孔內(nèi)顏色會(huì)逐漸變藍(lán)，且隨反應(yīng)時(shí)間加深，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度呈現(xiàn)明顯藍(lán)色差異（如高濃度孔深藍(lán)色、低濃度孔淺藍(lán)色）時(shí)，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長(zhǎng)，可在終止前檢測(cè)高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD600nm 值，當(dāng)達(dá)到 1.0 左右時(shí)終止，此時(shí)顯色反應(yīng)處于線性期，終止后顏色由藍(lán)變黃，信號(hào)強(qiáng)度約增強(qiáng) 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調(diào)整上，若標(biāo)曲擬合后未呈現(xiàn)明顯 S 型，可通過調(diào)整坐標(biāo)軸范圍優(yōu)化—如將縱軸（OD 值）范圍設(shè)為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設(shè)為對(duì)數(shù)坐標(biāo)，突出低濃度區(qū)的拐點(diǎn)與高濃度區(qū)的平臺(tái)區(qū)，使曲線更接近 S 型。此外，標(biāo)曲配制需確保濃度點(diǎn)單獨(dú)配制（非連續(xù)稀釋），避免高濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染低濃度點(diǎn)，導(dǎo)致低濃度區(qū)信號(hào)異常升高，破壞 S 型曲線形態(tài)。通過以上方法，可有效提升 S 型標(biāo)曲的成功率，保障熱原定量的準(zhǔn)確性。

MAT法熱原檢測(cè)中，標(biāo)曲信號(hào)值偏低或線性不佳是常見問題，需按細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品、ELISA 檢測(cè)三環(huán)節(jié)排查解決。細(xì)胞相關(guān)問題中，細(xì)胞復(fù)蘇后若未充分混勻?qū)е陆Y(jié)團(tuán)，種板后細(xì)胞分布不均，會(huì)使局部信號(hào)弱，需振蕩細(xì)胞懸液后再種板；細(xì)胞活性差或處理時(shí)間超半小時(shí)，會(huì)降低炎癥因子分泌，需嚴(yán)格按說明書操作并縮短處理時(shí)間；孵育未達(dá) 37℃、5% CO?條件，細(xì)胞活化不足，需確保培養(yǎng)箱參數(shù)穩(wěn)定；細(xì)胞懸液若接觸外源熱原，會(huì)引發(fā)非特異性反應(yīng)，操作時(shí)需遠(yuǎn)離熱原污染源。標(biāo)準(zhǔn)品問題方面，配制稀釋錯(cuò)誤會(huì)直接導(dǎo)致濃度不準(zhǔn)，需核對(duì)稀釋步驟；振蕩時(shí)間不足（未按說明書要求）會(huì)使內(nèi)毒素分散不均，需確保振蕩充分且 4 小時(shí)內(nèi)使用；標(biāo)準(zhǔn)品降解會(huì)導(dǎo)致效價(jià)下降，需按推薦條件保存（如 - 20℃冷凍）。ELISA 檢測(cè)環(huán)節(jié)，孵育時(shí)間短或振蕩速度慢會(huì)影響抗體結(jié)合，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育或提高振蕩速度；TMB 顯色不足（<3 分鐘）會(huì)導(dǎo)致信號(hào)低，需顯色 3-10 分鐘，待高濃度點(diǎn) OD600 達(dá) 1.0 時(shí)加終止液。

中國(guó)藥典對(duì) MAT 法熱原檢測(cè)要求 4 復(fù)孔，未明確 CV 限值，需結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)特性合理解讀與操作。藥典不設(shè) CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞活性易受環(huán)境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩(wěn)定性，過嚴(yán)的 CV 要求可能脫離實(shí)際；但實(shí)驗(yàn)室可通過積累多批次數(shù)據(jù)，制定內(nèi)部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測(cè)重復(fù)性。關(guān)于 3 復(fù)孔的適用性：若長(zhǎng)期數(shù)據(jù)顯示 CV 控制良好（如連續(xù) 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過程檢測(cè)（非 QC 放行），可嘗試 3 復(fù)孔，但需同步設(shè)置加標(biāo)對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)果可靠性；若為 QC 放行檢測(cè)，仍建議按 4 復(fù)孔操作，符合藥典下限要求。對(duì)于異常點(diǎn)處理，可采用狄克遜準(zhǔn)則（Q 檢驗(yàn)）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 —— 如某復(fù)孔 IL-6 檢測(cè)值偏離平均值 30% 以上，且無明顯操作誤差（如加樣錯(cuò)誤），可判定為異常點(diǎn)并剔除，但需在原始記錄中詳細(xì)說明原因，確保數(shù)據(jù)可追溯，避免隨意剔除導(dǎo)致結(jié)果失真。

MAT 法熱原檢測(cè)的關(guān)鍵機(jī)制是 “熱原活化單核細(xì)胞 TLR 受體，觸發(fā)炎癥因子分泌”，TLR 受體的全覆蓋是保障檢測(cè)無遺漏的關(guān)鍵。不同熱原需活化不同 TLR 受體：最常見的內(nèi)毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革蘭氏陽(yáng)性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缰妆谒幔┬杌罨?TLR2/6，真菌多糖活化?TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 試劑盒配套細(xì)胞需具備全覆蓋的 TLR 受體表達(dá)—湖州申科生物通過 Western blot 驗(yàn)證，其 HL-60 細(xì)胞系表達(dá) TLR1-TLR9，可響應(yīng)各類熱原。為進(jìn)一步驗(yàn)證覆蓋能力，申科用不同非內(nèi)毒素?zé)嵩潴w（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激細(xì)胞，結(jié)果顯示所有配體均能誘導(dǎo) IL-6 分泌，且呈良好量效關(guān)系，證明試劑盒可檢出各類熱原。若細(xì)胞 TLR 受體覆蓋不全（如缺失 TLR2），則無法檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩?，?dǎo)致漏檢風(fēng)險(xiǎn)，因此 TLR 受體的全覆蓋是 MAT 法熱原檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)之一。

家兔熱原試驗(yàn)作為熱原檢測(cè)領(lǐng)域的 “法定傳統(tǒng)方法”，被中國(guó)藥典（ChP）、美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測(cè)項(xiàng)目，其主要優(yōu)勢(shì)在于可通過家兔體溫應(yīng)答篩查所有類型熱原，尤其適用于無法排除非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜母唢L(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，如血液制品、放射性質(zhì)藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗(yàn)存在明顯局限：動(dòng)物個(gè)體差異大，需額外投入時(shí)間與成本篩選合格家兔；檢測(cè)周期長(zhǎng)（至少 6 小時(shí)），無法滿足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對(duì) LPS 檢測(cè)限≥5EU/kg），與全球倡導(dǎo)的“動(dòng)物福利3R原則”背道而馳。

在 MAT 法熱原檢測(cè)中，PBMC（外周血單核細(xì)胞）與單核細(xì)胞系各有優(yōu)劣，單核細(xì)胞系更適合標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。PBMC 的優(yōu)勢(shì)在于免疫細(xì)胞成分豐富（含單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等），對(duì)熱原反應(yīng)敏感，靈敏度相對(duì)較高；但局限同樣明顯 ——PBMC 需從不同供體獲取，供體免疫狀態(tài)差異會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，且無法長(zhǎng)期保存，難以建立標(biāo)準(zhǔn)化方法學(xué)。單核細(xì)胞系（如 HL-60、MM6、THP1）則克服了 PBMC 的局限：細(xì)胞來源穩(wěn)定（可批量培養(yǎng)），TLR 受體表達(dá)覆蓋主要亞型（如 HL-60 表達(dá) TLR1-TLR9），對(duì)熱原反應(yīng)重復(fù)性好，更適合商業(yè)化試劑盒與法規(guī)檢測(cè)。不同單核細(xì)胞系性能也有差異：MM6/IL-6 法檢測(cè)限約 0.05EU/mL，THP1/TNF-α 法因 TNF-α 為一級(jí)免疫效應(yīng)物檢測(cè)限更低，但 TNF-α 穩(wěn)定性差；HL-60/IL-6 法檢測(cè)限與穩(wěn)定性均優(yōu)于前兩者，成為主流選擇。湖州申科生物MAT試劑盒選用 HL-60 細(xì)胞系，正是基于其優(yōu)異的穩(wěn)定性與熱原響應(yīng)適配多場(chǎng)景，確保不同批次檢測(cè)結(jié)果一致。