抗體藥物熱原檢測流程

來源： 發(fā)布時間：2025-10-07

家兔熱原試驗作為熱原檢測領(lǐng)域的 “法定傳統(tǒng)方法”，被中國藥典（ChP）、美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測項目，其主要優(yōu)勢在于可通過家兔體溫應(yīng)答篩查所有類型熱原，尤其適用于無法排除非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜母唢L(fēng)險產(chǎn)品，如血液制品、放射性質(zhì)藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗存在明顯局限：動物個體差異大，需額外投入時間與成本篩選合格家兔；檢測周期長（至少 6 小時），無法滿足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對 LPS 檢測限≥5EU/kg），與全球倡導(dǎo)的“動物福利3R原則”背道而馳。
MAT 熱原檢測能幫助分析和解決生物制品生產(chǎn)中出現(xiàn)的低內(nèi)毒素回收（LER）現(xiàn)象。抗體藥物熱原檢測流程

抗體藥物熱原檢測流程,熱原檢測

生物制品（如單克隆抗體、重組蛋白、細(xì)胞因子）因基質(zhì)成分復(fù)雜（含高濃度蛋白質(zhì)、螯合劑、表面活性劑、緩沖鹽等），在熱原檢測過程中易出現(xiàn)“反應(yīng)抑制”或“非特異性增強”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。選擇抗干擾能力更強的檢測方法至關(guān)重要，重組級聯(lián)試劑（rCR）因采用完整級聯(lián)反應(yīng)路徑，抗干擾性優(yōu)于天然 LAL；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）對復(fù)雜基質(zhì)耐受性更高，通過適當(dāng)稀釋即可消除多數(shù)干擾，因此生物制品熱原檢測常采用 “rCR 法（內(nèi)毒素定量）+ MAT 法（全熱原篩查）” 的聯(lián)合方案，既保證內(nèi)毒素檢測的準(zhǔn)確性，又防控非內(nèi)毒素?zé)嵩L(fēng)險。
湖北熱原檢測風(fēng)險評估熱原檢測MAT法可在96孔板中批量檢測，單批次實驗1.5天即可放行，家兔法需3-7天。

抗體藥物熱原檢測流程,熱原檢測

MAT法熱原檢測中，獲得標(biāo)準(zhǔn) S 型標(biāo)曲需通過顯色時機控制與圖形調(diào)整實現(xiàn)，確保標(biāo)曲擬合準(zhǔn)確。在顯色時機控制上，加入 TMB 底物后，孔內(nèi)顏色會逐漸變藍(lán)，且隨反應(yīng)時間加深，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度呈現(xiàn)明顯藍(lán)色差異（如高濃度孔深藍(lán)色、低濃度孔淺藍(lán)色）時，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長，可在終止前檢測高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD600nm 值，當(dāng)達(dá)到 1.0 左右時終止，此時顯色反應(yīng)處于線性期，終止后顏色由藍(lán)變黃，信號強度約增強 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調(diào)整上，若標(biāo)曲擬合后未呈現(xiàn)明顯 S 型，可通過調(diào)整坐標(biāo)軸范圍優(yōu)化—如將縱軸（OD 值）范圍設(shè)為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設(shè)為對數(shù)坐標(biāo)，突出低濃度區(qū)的拐點與高濃度區(qū)的平臺區(qū)，使曲線更接近 S 型。此外，標(biāo)曲配制需確保濃度點單獨配制（非連續(xù)稀釋），避免高濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染低濃度點，導(dǎo)致低濃度區(qū)信號異常升高，破壞 S 型曲線形態(tài)。通過以上方法，可有效提升 S 型標(biāo)曲的成功率，保障熱原定量的準(zhǔn)確性。

MAT 試劑盒熱原檢測配套細(xì)胞的質(zhì)量控制，是保障檢測結(jié)果可靠的重要環(huán)節(jié)，需從功能、安全性、穩(wěn)定性三方面建立體系。在功能鑒定上，按歐洲 MAT 法要求，需檢測細(xì)胞的 Toll 樣受體（TLR1-TLR9）表達(dá)情況—確保細(xì)胞能響應(yīng)不同類型熱原（如 TLR4 響應(yīng) LPS、TLR2/6 響應(yīng)脂磷壁酸）；同時考察細(xì)胞倍增時間（確?；钚苑€(wěn)定）、熱原反應(yīng)性（對標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩男盘枏姸龋?，確保細(xì)胞具備熱原識別與炎癥因子分泌能力。在安全性檢測上，需驗證細(xì)胞無菌（無細(xì)菌、真菌污染）、無支原體、無外源病毒因子（如 HIV、HBV）及分枝桿菌，避免外源污染影響檢測結(jié)果。在穩(wěn)定性考察上，需監(jiān)測不同代次細(xì)胞的熱原刺激敏感性，一般要求細(xì)胞使用代次不超過 20 代，代次過高會導(dǎo)致 TLR 表達(dá)下降、炎癥因子分泌減少，影響檢測靈敏度。湖州申科的配套細(xì)胞還額外通過 Western blot 驗證 TLR 受體表達(dá)量，并用不同非內(nèi)毒素?zé)嵩潴w刺激驗證響應(yīng)性，形成全維度質(zhì)量控制，確保細(xì)胞適配熱原檢測需求。
湖州申科熱原檢測試劑盒聯(lián)合了國內(nèi)相關(guān)機構(gòu)室間驗證，與傳統(tǒng)RPT法結(jié)果高度一致，符合法規(guī)要求。

抗體藥物熱原檢測流程,熱原檢測

含消除炎癥成分的樣品可能抑制 IL-6 產(chǎn)生，需通過科學(xué)評估排除干擾，確保 MAT 法熱原檢測結(jié)果準(zhǔn)確。根據(jù)藥典要求，若樣品能抑制單核細(xì)胞促炎癥因子釋放，需通過以下步驟驗證適用性：首先，選擇樣品 A、2A、4A 倍稀釋（均不超過上限有效稀釋倍數(shù) MVD），避免高濃度消除炎癥成分過度抑制；其次，進(jìn)行供試品加標(biāo)回收率實驗，若回收率在 50%-200% 的合格范圍，說明消除炎癥成分未影響熱原檢測；再對比 “供試品配制的標(biāo)曲” 與 “稀釋液配制的標(biāo)曲”，若兩者 IL-6 檢測值相差在 ±20% 以內(nèi)，表明樣品基質(zhì)對檢測無系統(tǒng)性干擾。例如，某消除炎癥單抗樣品經(jīng) 2 倍稀釋后，加標(biāo)回收率達(dá) 120%，兩種標(biāo)曲 IL-6 值相差 15%，判定可適用 MAT 法。若出現(xiàn)回收率偏低（<50%），可嘗試增加稀釋倍數(shù)（如 8A 倍）或采用熱滅活（若樣品耐熱）去除消除炎癥活性；若仍無法排除干擾，需結(jié)合家兔法進(jìn)行對比驗證，避免因消除炎癥成分導(dǎo)致假陰性。
熱原檢測MAT零動物消耗，降低檢測成本，提升檢測效率和倫理水平。湖北熱原檢測風(fēng)險評估

無論是注射劑、生物制品，還是醫(yī)療器械的接觸材料，都能在我們的熱原檢測下，得到準(zhǔn)確的“安全認(rèn)證”。抗體藥物熱原檢測流程

湖州申科生物熱原檢測（MAT法） 試劑盒在靈敏度、穩(wěn)定性與適用性上表現(xiàn)突出，關(guān)鍵性能參數(shù)符合藥典要求：標(biāo)曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，相關(guān)系數(shù) R2≥0.98，定量限 0.025EU/mL，檢測限（LOD）0.0125EU/mL，批間精密度 CV≤25%，可準(zhǔn)確捕捉微量熱原。其優(yōu)勢在于特定的單核細(xì)胞系 —— 與依賴供體血液的 PBMC 細(xì)胞不同，申科 MAT 細(xì)胞系來源清晰可溯源，無需倫理審批與血站合作，規(guī)避供體差異導(dǎo)致的檢測波動。對比同類型產(chǎn)品（如國外廠家 PBMC 細(xì)胞），申科細(xì)胞系的標(biāo)曲各濃度點 CV 更低（ 低至3.6%）、相對偏差更小（ 12.31%），線性 R2 達(dá) 1.000，穩(wěn)定性更優(yōu)。此外，細(xì)胞凍存液組分經(jīng)優(yōu)化，復(fù)蘇后活率高，無需額外調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)即可直接與供試品共孵育，操作便捷；且適配任何具備 450nm 波長的酶標(biāo)儀，無需專門的設(shè)備，降低實驗室投入成本。
抗體藥物熱原檢測流程