江蘇生物制品熱原檢測技術升級

來源： 發(fā)布時間：2025-10-14

熱原檢測技術自 20 世紀初問世以來，經(jīng)歷了 “動物試驗→體外生化檢測→細胞生物學檢測” 的三次關鍵變革，每一次變革均推動檢測效率、準確性與全面性的提升。20 世紀初至中期，熱原檢測方法只有家兔熱原試驗，通過觀察家兔體溫變化篩查熱原，雖實現(xiàn)了廣譜檢測，但存在動物成本高、操作繁瑣、靈敏度低、種屬差異大等局限，難以滿足制藥行業(yè)快速發(fā)展需求。20 世紀 60 年代，鱟試驗法（LAL 法）的發(fā)明開啟了熱原檢測的 “體外生化時代”，利用鱟血變形細胞裂解物的凝血級聯(lián)反應檢測細菌內(nèi)毒素，靈敏度提升至 ng 級，檢測時間縮短至 1-2 小時，迅速成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法；但該方法依賴鱟資源，易受 β- 葡聚糖干擾，且只能檢測內(nèi)毒素，無法覆蓋非內(nèi)毒素熱原。21 世紀以來，重組技術與細胞生物學技術的發(fā)展推動熱原檢測進入 “全熱原管控時代”：重組級聯(lián)試劑（rCR）與重組 C 因子試劑（rFC）通過基因工程技術制備，擺脫對鱟資源的依賴，消除葡聚糖干擾，實現(xiàn)標準化生產(chǎn)；單核細胞活化反應測定（MAT）利用人源單核細胞檢測全類型熱原，填補非內(nèi)毒素熱原檢測空白，且結(jié)果更貼近人體實際反應。
MAT 法檢測革蘭氏陽性菌注射劑，需排查非內(nèi)毒素熱原（如 LTA），避免只測內(nèi)毒素漏檢。江蘇生物制品熱原檢測技術升級

江蘇生物制品熱原檢測技術升級,熱原檢測

PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒依據(jù) ICH Q2 (R2)、《中國藥典》（如通則 9301）及歐洲藥典（EP 2.6.30）要求，完成了線性、范圍、定量限、準確度、精密度、耐用性等全維度性能驗證。線性方面，0.0125-1.0EU/mL范圍內(nèi)擬合良好，R2≥0.98；準確度通過加標回收實驗驗證，不同樣品基質(zhì)（如生物制品、化學制藥原料）的回收率均落在 50%-200% 區(qū)間；精密度表現(xiàn)優(yōu)異，批內(nèi)與批間 CV 均≤15%，且無論是 3 復孔還是 4 復孔檢測均能達標。此外，試劑盒使用中國藥典推薦的 MAT 特定標準品，可直接用于國內(nèi)外申報，契合全球 “3R 原則” 監(jiān)管導向—尤其適配《歐洲藥典》刪除家兔法、《美國藥典》鼓勵 MAT 替代等新法規(guī)趨勢，為企業(yè)應對不同地區(qū)的熱原檢測合規(guī)要求提供有力支持。
江蘇生物制品熱原檢測技術升級與傳統(tǒng)方法相比，MAT 法能更覆蓋各類熱原，保障產(chǎn)品安全性。

江蘇生物制品熱原檢測技術升級,熱原檢測

MAT法熱原檢測中，標曲信號值偏低或線性不佳是常見問題，需按細胞、標準品、ELISA 檢測三環(huán)節(jié)排查解決。細胞相關問題中，細胞復蘇后若未充分混勻?qū)е陆Y(jié)團，種板后細胞分布不均，會使局部信號弱，需振蕩細胞懸液后再種板；細胞活性差或處理時間超半小時，會降低炎癥因子分泌，需嚴格按說明書操作并縮短處理時間；孵育未達 37℃、5% CO?條件，細胞活化不足，需確保培養(yǎng)箱參數(shù)穩(wěn)定；細胞懸液若接觸外源熱原，會引發(fā)非特異性反應，操作時需遠離熱原污染源。標準品問題方面，配制稀釋錯誤會直接導致濃度不準，需核對稀釋步驟；振蕩時間不足（未按說明書要求）會使內(nèi)毒素分散不均，需確保振蕩充分且 4 小時內(nèi)使用；標準品降解會導致效價下降，需按推薦條件保存（如 - 20℃冷凍）。ELISA 檢測環(huán)節(jié)，孵育時間短或振蕩速度慢會影響抗體結(jié)合，可適當延長孵育或提高振蕩速度；TMB 顯色不足（<3 分鐘）會導致信號低，需顯色 3-10 分鐘，待高濃度點 OD600 達 1.0 時加終止液。

MAT 法熱原檢測中，細胞傳代的代次控制是保障檢測穩(wěn)定性的關鍵，需結(jié)合細胞特性與文獻數(shù)據(jù)制定標準。參考行業(yè)文獻，單核細胞系（如 HL-60、THP1）的使用代次通常不超過 20 代，代次過高會導致細胞生物學特性改變：一是 TLR 受體表達下降，如 TLR4 表達量在 20 代后下降 40%，導致內(nèi)毒素檢測靈敏度降低；二是細胞倍增時間延長，從 24 小時延長至 36 小時，影響共培養(yǎng)時長的準確性；三是炎癥因子分泌減少，IL-6 分泌量在 20 代后下降 35%，導致熱原濃度低估。申科對配套的 HL-60 細胞系進行代次穩(wěn)定性驗證，結(jié)果顯示：1-15 代細胞的熱原響應性一致（加標回收率 85%-125%），16-20 代回收率波動至 70%-130%，21 代后回收率 < 70%，因此建議控制在 1-15 代使用。實驗室需建立細胞代次記錄制度，每傳代 1 次記錄代次，達到 15 代后及時更換新批次細胞，并驗證新批次細胞與舊批次的一致性（如檢測同一樣品，結(jié)果偏差≤20%），確保不同代次細胞的檢測結(jié)果穩(wěn)定。
憑借深厚的專業(yè)積累，湖州申科生物為行業(yè)提供可靠的熱原檢測解決方案。

江蘇生物制品熱原檢測技術升級,熱原檢測

PBMC（外周血單個核細胞）的復雜制備流程嚴重制約熱原檢測效率。首先，血源獲取受獻血者數(shù)量、時間及采集血液政策限制，無法按需即時獲?。黄浯?，需嚴格執(zhí)行 EP2.6.30 規(guī)定的標志物檢測，增加前期準備時間；再進行采集血液、分離單核細胞、凍存等環(huán)節(jié)需全程無菌操作，步驟繁瑣且易引入污染風險。相比之下，單核細胞系可工業(yè)化培養(yǎng)，制備流程簡單可控，能快速提供合格細胞，避免因 PBMC 制備延誤熱原檢測進度，更適配批量樣品的高效質(zhì)控。歐洲藥典通則 2.6.30 明確 MAT 可替代家兔法熱原檢查，能同時檢測內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素熱原。江蘇生物制品熱原檢測技術升級

單核細胞活化試驗MAT通過量化人源單核細胞的免疫應答，實現(xiàn)對LPS、脂磷壁酸、β-葡聚糖的同步檢測。江蘇生物制品熱原檢測技術升級

在 MAT 法熱原檢測中，PBMC（外周血單核細胞）與單核細胞系各有優(yōu)劣，單核細胞系更適合標準化檢測。PBMC 的優(yōu)勢在于免疫細胞成分豐富（含單核細胞、淋巴細胞等），對熱原反應敏感，靈敏度相對較高；但局限同樣明顯 ——PBMC 需從不同供體獲取，供體免疫狀態(tài)差異會導致檢測結(jié)果不穩(wěn)定，且無法長期保存，難以建立標準化方法學。單核細胞系（如 HL-60、MM6、THP1）則克服了 PBMC 的局限：細胞來源穩(wěn)定（可批量培養(yǎng)），TLR 受體表達覆蓋主要亞型（如 HL-60 表達 TLR1-TLR9），對熱原反應重復性好，更適合商業(yè)化試劑盒與法規(guī)檢測。不同單核細胞系性能也有差異：MM6/IL-6 法檢測限約 0.05EU/mL，THP1/TNF-α 法因 TNF-α 為一級免疫效應物檢測限更低，但 TNF-α 穩(wěn)定性差；HL-60/IL-6 法檢測限與穩(wěn)定性均優(yōu)于前兩者，成為主流選擇。湖州申科生物MAT試劑盒選用 HL-60 細胞系，正是基于其優(yōu)異的穩(wěn)定性與熱原響應適配多場景，確保不同批次檢測結(jié)果一致。
江蘇生物制品熱原檢測技術升級