四川熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法

來源： 發(fā)布時間：2025-11-03

PBMC（外周血單個核細(xì)胞）用于 MAT 熱原檢測時，存在異質(zhì)性與血源供應(yīng)兩大關(guān)鍵問題。從異質(zhì)性來看，PBMC 含 12% 單核細(xì)胞與 88% 淋巴細(xì)胞，且來自不同供體，細(xì)胞組成、功能狀態(tài)及熱原反應(yīng)存在明顯差異，導(dǎo)致熱原刺激后 IL-6 釋放量波動大，標(biāo)準(zhǔn)化難度高。血源供應(yīng)方面，除受獻血者數(shù)量、時間及采集血液政策限制外，EP2.6.30 還要求嚴(yán)格檢測乙肝、丙肝等標(biāo)志物，且采集血液、處理、試劑制備全程需無菌操作，流程環(huán)節(jié)多、復(fù)雜度高，遠(yuǎn)不及單核細(xì)胞系制備簡便，易影響熱原檢測的時效性與穩(wěn)定性。PyroSHENTEK熱原檢測試劑盒采用“單核細(xì)胞+ELISA”標(biāo)準(zhǔn)化體系，檢測結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。四川熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法

四川熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法,熱原檢測

PBMC（外周血單個核細(xì)胞）的供體差異會直接導(dǎo)致熱原檢測結(jié)果的波動，主要體現(xiàn)在 IL-6 釋放水平的不一致。不同供體的 PBMC，其單核細(xì)胞比例、TLR 受體表達量、免疫活性狀態(tài)存在差異：有的供體 PBMC 受熱原刺激后， IL-6 釋放量高；有的則極低，甚至無明顯響應(yīng)。實驗數(shù)據(jù)顯示， PBMC 的標(biāo)曲各濃度點相對偏差有高達 171.43%的，正是這種差異的體現(xiàn)，導(dǎo)致熱原檢測結(jié)果難以標(biāo)準(zhǔn)化，無法準(zhǔn)確判斷供試品熱原是否超標(biāo)，從而增加了藥品的質(zhì)量控制風(fēng)險。
合規(guī)性熱原檢測操作步驟湖州申科MAT試劑盒適用于生物制品、化學(xué)制藥、原料藥、化妝品、醫(yī)療器械的熱原檢測。

四川熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法,熱原檢測

在單核細(xì)胞活化試驗（MAT）的熱原檢測中，IL-6 被確定為關(guān)鍵檢測指標(biāo)，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在穩(wěn)定性、生物學(xué)關(guān)聯(lián)性及商業(yè)化應(yīng)用上的優(yōu)勢。從穩(wěn)定性來看，IL-6 在體外培養(yǎng)環(huán)境中受個體免疫狀態(tài)影響較小，半衰期更長，實驗重復(fù)性更優(yōu)，且檢測靈敏度高，能準(zhǔn)確定量熱原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 產(chǎn)生時間短、表達量低，還易被蛋白酶降解，導(dǎo)致檢測信號波動大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。從生物學(xué)特性而言，IL-6 是先天免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可通過活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驅(qū)動急性期反應(yīng)，如誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生前列腺素 E2（PGE2）觸發(fā)發(fā)熱，與熱原的致熱機制直接關(guān)聯(lián)，是公認(rèn)的發(fā)熱標(biāo)志物。同時，MAT 法熱原檢測會輔以 IL-1β 和 TNF-α 監(jiān)測 ——IL-1β 反映單核細(xì)胞活化程度，TNF-α 提示炎癥放大效應(yīng)，形成多因子協(xié)同體系。此外，IL-6 的 ELISA 試劑盒市場成熟度高、跨平臺兼容性強，而 IL-1β 和 TNF-α 的檢測方法在靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化上仍有局限，進一步奠定了 IL-6 的重要地位。

單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）是近年來熱原檢測領(lǐng)域的突破性技術(shù)，其原理基于人體免疫系統(tǒng)對熱原的天然應(yīng)答機制：人源單核細(xì)胞（如 THP-1 細(xì)胞系或新鮮人全血單核細(xì)胞）在熱原刺激下，會活化胞內(nèi)炎癥信號通路，釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，通過 ELISA 檢測細(xì)胞因子的濃度，即可間接反映樣品中熱原的總量與活性。與傳統(tǒng)檢測方法相比，MAT 法具備三大不可替代的優(yōu)勢：一是廣譜性，可同時檢測細(xì)菌內(nèi)毒素、病毒、真菌毒素、支原體等所有類型熱原，填補了鱟試驗法只能檢測內(nèi)毒素的 “非內(nèi)毒素?zé)嵩^(qū)”，尤其適用于疫苗、基因治療產(chǎn)品等易受多種熱原污染的高風(fēng)險產(chǎn)品；二是人源相關(guān)性，采用與人體同源的細(xì)胞模型，檢測結(jié)果更貼近臨床實際熱原反應(yīng)，避免家兔試驗中動物種屬差異導(dǎo)致的誤判；三是高靈敏度，對細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測限可達 0.0125EU/mL，對非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缃湍付嗵?、腺病毒）的檢測限低至 ng/pg 級，滿足低限值產(chǎn)品的質(zhì)控需求。
MAT 熱原檢測中細(xì)胞活性影響巨大，活率需達一定標(biāo)準(zhǔn)保證檢測效果。

四川熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法,熱原檢測

MAT法熱原檢測中，獲得標(biāo)準(zhǔn) S 型標(biāo)曲需通過顯色時機控制與圖形調(diào)整實現(xiàn)，確保標(biāo)曲擬合準(zhǔn)確。在顯色時機控制上，加入 TMB 底物后，孔內(nèi)顏色會逐漸變藍，且隨反應(yīng)時間加深，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度呈現(xiàn)明顯藍色差異（如高濃度孔深藍色、低濃度孔淺藍色）時，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長，可在終止前檢測高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD600nm 值，當(dāng)達到 1.0 左右時終止，此時顯色反應(yīng)處于線性期，終止后顏色由藍變黃，信號強度約增強 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調(diào)整上，若標(biāo)曲擬合后未呈現(xiàn)明顯 S 型，可通過調(diào)整坐標(biāo)軸范圍優(yōu)化—如將縱軸（OD 值）范圍設(shè)為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設(shè)為對數(shù)坐標(biāo)，突出低濃度區(qū)的拐點與高濃度區(qū)的平臺區(qū)，使曲線更接近 S 型。此外，標(biāo)曲配制需確保濃度點單獨配制（非連續(xù)稀釋），避免高濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染低濃度點，導(dǎo)致低濃度區(qū)信號異常升高，破壞 S 型曲線形態(tài)。通過以上方法，可有效提升 S 型標(biāo)曲的成功率，保障熱原定量的準(zhǔn)確性。
MAT 法通過熱原活化單核細(xì)胞 TLR 受體，釋放 IL-6 等細(xì)胞因子，ELISA 檢測 IL-6 推算熱原含量。北京疫苗熱原檢測商業(yè)化試劑盒

中國藥典9301已將MAT列為熱原檢測的補充方法，美國藥典鼓勵企業(yè)采用經(jīng)過驗證的MAT替代家兔法。四川熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法

在 MAT 法熱原檢測中，PBMC（外周血單核細(xì)胞）與單核細(xì)胞系各有優(yōu)劣，單核細(xì)胞系更適合標(biāo)準(zhǔn)化檢測。PBMC 的優(yōu)勢在于免疫細(xì)胞成分豐富（含單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等），對熱原反應(yīng)敏感，靈敏度相對較高；但局限同樣明顯 ——PBMC 需從不同供體獲取，供體免疫狀態(tài)差異會導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定，且無法長期保存，難以建立標(biāo)準(zhǔn)化方法學(xué)。單核細(xì)胞系（如 HL-60、MM6、THP1）則克服了 PBMC 的局限：細(xì)胞來源穩(wěn)定（可批量培養(yǎng)），TLR 受體表達覆蓋主要亞型（如 HL-60 表達 TLR1-TLR9），對熱原反應(yīng)重復(fù)性好，更適合商業(yè)化試劑盒與法規(guī)檢測。不同單核細(xì)胞系性能也有差異：MM6/IL-6 法檢測限約 0.05EU/mL，THP1/TNF-α 法因 TNF-α 為一級免疫效應(yīng)物檢測限更低，但 TNF-α 穩(wěn)定性差；HL-60/IL-6 法檢測限與穩(wěn)定性均優(yōu)于前兩者，成為主流選擇。湖州申科生物MAT試劑盒選用 HL-60 細(xì)胞系，正是基于其優(yōu)異的穩(wěn)定性與熱原響應(yīng)適配多場景，確保不同批次檢測結(jié)果一致。
四川熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法