天津熱原檢測(cè)體系

來(lái)源： 發(fā)布時(shí)間：2025-11-10

生物制品（如單克隆抗體、重組蛋白、細(xì)胞因子）因基質(zhì)成分復(fù)雜（含高濃度蛋白質(zhì)、螯合劑、表面活性劑、緩沖鹽等），在熱原檢測(cè)過(guò)程中易出現(xiàn)“反應(yīng)抑制”或“非特異性增強(qiáng)”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。選擇抗干擾能力更強(qiáng)的檢測(cè)方法至關(guān)重要，重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）因采用完整級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑，抗干擾性優(yōu)于天然 LAL；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定（MAT）對(duì)復(fù)雜基質(zhì)耐受性更高，通過(guò)適當(dāng)稀釋即可消除多數(shù)干擾，因此生物制品熱原檢測(cè)常采用 “rCR 法（內(nèi)毒素定量）+ MAT 法（全熱原篩查）” 的聯(lián)合方案，既保證內(nèi)毒素檢測(cè)的準(zhǔn)確性，又防控非內(nèi)毒素?zé)嵩L(fēng)險(xiǎn)。
熱原進(jìn)入血液后，TLR信號(hào)迅速活化NF-κB通路，驅(qū)動(dòng)單核細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α因子風(fēng)暴。天津熱原檢測(cè)體系

天津熱原檢測(cè)體系,熱原檢測(cè)

革蘭氏陽(yáng)性菌注射劑產(chǎn)品只依賴內(nèi)毒素檢測(cè)存在安全風(fēng)險(xiǎn)，需結(jié)合熱原檢測(cè)特性制定防控方案。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，而革蘭氏陽(yáng)性菌可產(chǎn)生非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EPs），如脂磷壁酸，這類(lèi)物質(zhì)同樣能引發(fā)人體發(fā)熱反應(yīng)，若只檢測(cè)內(nèi)毒素，可能遺漏 NEPs 污染，導(dǎo)致臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)此，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需重點(diǎn)關(guān)注三點(diǎn)：一是建議開(kāi)展家兔法與內(nèi)毒素檢測(cè)的一致性實(shí)驗(yàn)，對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，排查是否存在內(nèi)毒素未檢出但家兔法陽(yáng)性的情況；二是采用 MAT 法熱原檢測(cè)，其通過(guò)單核細(xì)胞活化機(jī)制，可同時(shí)識(shí)別內(nèi)毒素與 NEPs，若 MAT 法檢測(cè)陽(yáng)性，需進(jìn)一步追溯 NEPs 來(lái)源；三是若無(wú)法排除 NEPs 風(fēng)險(xiǎn)，必須按藥典要求補(bǔ)充熱原檢測(cè)（如 MAT 法或家兔法），而非只依賴內(nèi)毒素檢測(cè)。尤其對(duì)于新藥或工藝變更后的產(chǎn)品，需通過(guò)多方法驗(yàn)證，確保熱原檢測(cè)覆蓋所有潛在致熱物質(zhì)，保障臨床用藥安全。
浙江熱原檢測(cè)體系基于人體免疫機(jī)制的 MAT 熱原檢測(cè)，為熱原檢測(cè)提供了新的可靠途徑。

天津熱原檢測(cè)體系,熱原檢測(cè)

MAT 法與傳統(tǒng)家兔法在熱原檢測(cè)中，性能差異明顯，MAT 法在準(zhǔn)確性、效率與合規(guī)性上更具優(yōu)勢(shì)。從結(jié)果評(píng)判來(lái)看，MAT 法以 “加標(biāo)回收率 50%-200%、供試品濃度 < 規(guī)定限值（CLC）” 為合格標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度達(dá) 0.0125EU/mL，可準(zhǔn)確定量熱原濃度；而家兔法只能定性（觀察體溫升高），靈敏度低（約 0.1-0.5EU/mL），易因家兔個(gè)體差異（如免疫狀態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)）導(dǎo)致假陰性。從檢測(cè)效率來(lái)看，MAT 法樣品與細(xì)胞共培養(yǎng) 24 小時(shí)即可出結(jié)果，且可批量檢測(cè)（96 孔板一次處理多個(gè)樣品）；家兔法需連續(xù)觀察 72 小時(shí)，每次只能檢測(cè)少量樣品，耗時(shí)且人力成本高。從合規(guī)性來(lái)看，MAT 法不使用動(dòng)物，符合 3R 原則，已被歐盟接受（EP 刪除家兔法）；家兔法因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屬性，面臨歐盟等地區(qū)的法規(guī)限制。此外，MAT 法重復(fù)性優(yōu)（復(fù)孔 CV 可控制在 30% 以內(nèi)），家兔法因個(gè)體差異 CV 常超 50%，進(jìn)一步凸顯 MAT 法在現(xiàn)代熱原檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)。

PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）用于 MAT 熱原檢測(cè)時(shí)，存在異質(zhì)性與血源供應(yīng)兩大關(guān)鍵問(wèn)題。從異質(zhì)性來(lái)看，PBMC 含 12% 單核細(xì)胞與 88% 淋巴細(xì)胞，且來(lái)自不同供體，細(xì)胞組成、功能狀態(tài)及熱原反應(yīng)存在明顯差異，導(dǎo)致熱原刺激后 IL-6 釋放量波動(dòng)大，標(biāo)準(zhǔn)化難度高。血源供應(yīng)方面，除受獻(xiàn)血者數(shù)量、時(shí)間及采集血液政策限制外，EP2.6.30 還要求嚴(yán)格檢測(cè)乙肝、丙肝等標(biāo)志物，且采集血液、處理、試劑制備全程需無(wú)菌操作，流程環(huán)節(jié)多、復(fù)雜度高，遠(yuǎn)不及單核細(xì)胞系制備簡(jiǎn)便，易影響熱原檢測(cè)的時(shí)效性與穩(wěn)定性。細(xì)胞因子IL-6因穩(wěn)定性高、半衰期長(zhǎng)，被選為熱原檢測(cè)MAT法關(guān)鍵定量指標(biāo)，優(yōu)于TNF-α與IL-1β。

天津熱原檢測(cè)體系,熱原檢測(cè)

PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）的供體差異會(huì)直接導(dǎo)致熱原檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)，主要體現(xiàn)在 IL-6 釋放水平的不一致。不同供體的 PBMC，其單核細(xì)胞比例、TLR 受體表達(dá)量、免疫活性狀態(tài)存在差異：有的供體 PBMC 受熱原刺激后， IL-6 釋放量高；有的則極低，甚至無(wú)明顯響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示， PBMC 的標(biāo)曲各濃度點(diǎn)相對(duì)偏差有高達(dá) 171.43%的，正是這種差異的體現(xiàn)，導(dǎo)致熱原檢測(cè)結(jié)果難以標(biāo)準(zhǔn)化，無(wú)法準(zhǔn)確判斷供試品熱原是否超標(biāo)，從而增加了藥品的質(zhì)量控制風(fēng)險(xiǎn)。
當(dāng)熱原侵入人體循環(huán)系統(tǒng)，單核細(xì)胞表面的TLR即刻化身分子雷達(dá)，準(zhǔn)確捕獲LPS、LTA等外源致熱物。北京原料藥熱原檢測(cè)常見(jiàn)問(wèn)題分析

單核細(xì)胞活化試驗(yàn)MAT通過(guò)量化人源單核細(xì)胞的免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)對(duì)LPS、脂磷壁酸、β-葡聚糖的同步檢測(cè)。天津熱原檢測(cè)體系

傳統(tǒng)熱原檢測(cè)方法的局限性十分明顯：鱟試驗(yàn)法只能特異性識(shí)別細(xì)菌內(nèi)毒素，對(duì)非內(nèi)毒素?zé)嵩耆珶o(wú)響應(yīng)；家兔熱原試驗(yàn)雖能篩查全類(lèi)型熱原，但靈敏度低（檢測(cè)限≥5EU/kg），無(wú)法檢出微量非內(nèi)毒素?zé)嵩?，且無(wú)法區(qū)分熱原類(lèi)型，難以追溯污染源頭；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定（MAT）的出現(xiàn)有效解決了上述難題，其關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于：基于人源單核細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制，可同時(shí)識(shí)別所有具備生物活性的熱原（包括內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素），且檢測(cè)靈敏度高（對(duì)病毒熱原檢測(cè)限低至pg級(jí)）；檢測(cè)周期短（24-48小時(shí)），可滿足產(chǎn)品快速放行需求；能通過(guò)細(xì)胞因子濃度定量評(píng)估熱原活性，避免“無(wú)活性熱原”的誤判。
天津熱原檢測(cè)體系