浙江Vero宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測

美國藥典 <1132> 與歐洲藥典 < 2.6.34 > 建議，對即將進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)（臨床 III 期及后續(xù)階段）或生產(chǎn)工藝已穩(wěn)定的生物制品，采用定制化 ELISA 試劑盒開展宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測，背后原因主要包括四點：①確保檢測方法能充分覆蓋實際工藝產(chǎn)生的 HCPs，防止漏檢關(guān)鍵雜質(zhì)；②為更準(zhǔn)確的免疫原性與安全性評估提供支持；③提供真實的工藝表征數(shù)據(jù)，而非推測性數(shù)據(jù)；④滿足商業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量控制對方法一致性的要求。此外，研究人員對當(dāng)前市場常見的 HCP ELISA 商業(yè)化試劑盒進(jìn)行測試，并將其與 HCP ELISA 定制化試劑盒對比。實驗結(jié)果顯示，不同商業(yè)化試劑盒檢測同一樣品的數(shù)值差異明顯，且準(zhǔn)確性均低于定制化試劑盒 —— 這一結(jié)果表明，定制化試劑盒更能滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制的實際需求。

目前利用 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的病毒包括狂犬病病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，種類多樣，生產(chǎn)工藝也各有不同。湖州申科生物的 Vero 細(xì)胞裂解型 HCP 殘留檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法），針對工藝中 Vero 細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的大量不同類型 HCPs，可定量檢測采用 Vero 細(xì)胞系生產(chǎn)且經(jīng)細(xì)胞裂解工藝收獲的生物制品中宿主細(xì)胞蛋白殘留，其抗體和校準(zhǔn)品可覆蓋近 3000 種蛋白。該試劑盒操作簡便，能提升實驗人員的時間利用效率?？贵w覆蓋率分別為 65.1%-85.1%（IMBS-2D）和 76.9%（IMBS-MS，Unique Peptide≥2）。試劑盒嚴(yán)格依據(jù) ISO13485 質(zhì)量體系生產(chǎn)，且按法規(guī)要求完成性能驗證，各項性能均滿足 Vero 宿主細(xì)胞蛋白檢測需求。

湖州申科生物依托先進(jìn)的整合技術(shù)平臺，在 HCP 檢測領(lǐng)域構(gòu)筑優(yōu)勢。公司自主研發(fā)出突破性技術(shù)，包括基于 IMBS 的抗體覆蓋率檢測方法與基于核酸文庫的低豐度 HCP 富集技術(shù)，有效提升 HCP 檢測靈敏度與抗體覆蓋能力，相關(guān)成果已在《中國新藥雜志》《藥物分析雜志》等期刊發(fā)表，且被納入國家科技重大專項。同時，借助前沿的精密分析平臺，湖州申科打造了覆蓋完整 HCP 分析鏈條的 LC-MS 解決方案，涵蓋抗原一致性評價、IMBS 前處理、低豐度蛋白富集、生信分析及專屬數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，構(gòu)建起從樣品管理到風(fēng)險分析的閉環(huán)體系。該平臺嚴(yán)格遵循法規(guī)要求，所有檢測技術(shù)均通過符合 ICH 及藥典標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)驗證，確保檢測數(shù)據(jù)可靠，且滿足生物制品申報（如 IND/BLA）的法規(guī)要求。憑借這一技術(shù)整合能力，公司已為國內(nèi)外上百家生物醫(yī)藥企業(yè)提供從工藝開發(fā)到質(zhì)控放行的一站式 HCP 檢測服務(wù)，助力單抗、疫苗等產(chǎn)品提升安全性與合規(guī)性。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）多與細(xì)胞關(guān)鍵功能相關(guān)，例如細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活及凋亡等，在生產(chǎn)工藝中會因細(xì)胞分泌、死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過程里，有三大因素主要影響 HCP 的組成與豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在 HCP 數(shù)量可能極多，且并非所有基因都會表達(dá)，部分基因的表達(dá)具有時間和條件特異性；像大腸桿菌約含 4300 個基因，不同工藝產(chǎn)物會經(jīng)歷獨特的翻譯后修飾，這增加了 HCP 的總數(shù)與生化復(fù)雜性。研究顯示，大腸桿菌表達(dá)的蛋白間存在數(shù)量差異，這種差異可能是對環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但 85-90% 具有潛在免疫原性的 HCP 在不同發(fā)酵過程中均會出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體及輔助成分構(gòu)成的體系，可實現(xiàn)穩(wěn)定、瞬時及誘導(dǎo)表達(dá)；以大腸桿菌為例，常見表達(dá)形式包括胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性包涵體形式，還有融合與非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品自身特性的影響：純化過程中能去除 99% 以上的 HCP，但仍有少量殘留 HCP 留在產(chǎn)品中，這些殘留 HCP 可能與產(chǎn)品結(jié)合，隨產(chǎn)品一同被純化。

定制化試劑盒之所以成為宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測的優(yōu)先選擇，關(guān)鍵原因之一是其構(gòu)建的檢測體系更契合商業(yè)化生產(chǎn)中HCP工藝雜質(zhì)的控制需求。在HCP校準(zhǔn)品與HCP抗體這兩大關(guān)鍵試劑組分達(dá)標(biāo)后，定制化方法的建立與優(yōu)化會依托真實的純化中間品及原液樣品開展——通過優(yōu)化檢測條件提升對低濃度HCP的檢測靈敏度，從而滿足工藝驗證與過程控制的需求。臨床三期階段需對生產(chǎn)工藝開展系統(tǒng)驗證，以保障其穩(wěn)定性與可重復(fù)性，而定制化HCPELISA檢測方法能更準(zhǔn)確地監(jiān)測工藝中HCP的去除效果，為工藝驗證提供堅實支撐。過程控制環(huán)節(jié)，借助工藝特異型HCP ELISA檢測方法，可實時監(jiān)測生產(chǎn)過程中的HCP水平，擁有更強(qiáng)的生產(chǎn)異常預(yù)警能力，能及時排查生產(chǎn)風(fēng)險，保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測中，抗體覆蓋率評估實驗的操作難度較高，需在實驗方法建立階段對關(guān)鍵步驟開展充分驗證，以確保實驗方法具備穩(wěn)健性。湖州申科研發(fā)的磁珠捕獲式 IMBS 技術(shù)（immunomagnetic beads separation，免疫磁珠分離），在開發(fā)過程中已對關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分驗證，相關(guān)驗證結(jié)果已通過專業(yè)評審，具體驗證內(nèi)容（部分）如下：① 方法優(yōu)化：圍繞磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)開展優(yōu)化驗證，確保方法穩(wěn)健性；② 過程質(zhì)控：二維電泳存在實驗步驟繁瑣、時間跨度大、中間環(huán)節(jié)難把控等問題，因此在等電聚焦實驗環(huán)節(jié)引入熒光標(biāo)記多肽，可快速判定等電聚焦效果；同時在 SDS-PAGE 電泳兩側(cè)增設(shè) 40 ng 銀染質(zhì)控樣品，用于控制銀染顯色過程；③ 方法重復(fù)性：針對 2D 分析與 LC-MS 分析開展重復(fù)性驗證，其中 2D 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 80% 以上，LC-MS 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 90% 以上；④ 上樣量優(yōu)化：針對 2D 分析與 LC-MS 分析實施上樣量驗證，規(guī)避上樣量差異對檢測結(jié)果的影響；⑤ 假陽性排查：排查樣品與陰性抗體間是否存在非特異性結(jié)合，確認(rèn) IMBS 實驗設(shè)定的步驟與參數(shù)是否會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。