河南熱原檢測操作步驟

MAT法熱原檢測中，標(biāo)曲信號值偏低或線性不佳是常見問題，需按細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品、ELISA 檢測三環(huán)節(jié)排查解決。細(xì)胞相關(guān)問題中，細(xì)胞復(fù)蘇后若未充分混勻?qū)е陆Y(jié)團(tuán)，種板后細(xì)胞分布不均，會(huì)使局部信號弱，需振蕩細(xì)胞懸液后再種板；細(xì)胞活性差或處理時(shí)間超半小時(shí)，會(huì)降低炎癥因子分泌，需嚴(yán)格按說明書操作并縮短處理時(shí)間；孵育未達(dá) 37℃、5% CO?條件，細(xì)胞活化不足，需確保培養(yǎng)箱參數(shù)穩(wěn)定；細(xì)胞懸液若接觸外源熱原，會(huì)引發(fā)非特異性反應(yīng)，操作時(shí)需遠(yuǎn)離熱原污染源。標(biāo)準(zhǔn)品問題方面，配制稀釋錯(cuò)誤會(huì)直接導(dǎo)致濃度不準(zhǔn)，需核對稀釋步驟；振蕩時(shí)間不足（未按說明書要求）會(huì)使內(nèi)毒素分散不均，需確保振蕩充分且 4 小時(shí)內(nèi)使用；標(biāo)準(zhǔn)品降解會(huì)導(dǎo)致效價(jià)下降，需按推薦條件保存（如 - 20℃冷凍）。ELISA 檢測環(huán)節(jié)，孵育時(shí)間短或振蕩速度慢會(huì)影響抗體結(jié)合，可適當(dāng)延長孵育或提高振蕩速度；TMB 顯色不足（<3 分鐘）會(huì)導(dǎo)致信號低，需顯色 3-10 分鐘，待高濃度點(diǎn) OD600 達(dá) 1.0 時(shí)加終止液。

在 MAT 法熱原檢測中，PBMC（外周血單核細(xì)胞）與單核細(xì)胞系各有優(yōu)劣，單核細(xì)胞系更適合標(biāo)準(zhǔn)化檢測。PBMC 的優(yōu)勢在于免疫細(xì)胞成分豐富（含單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等），對熱原反應(yīng)敏感，靈敏度相對較高；但局限同樣明顯 ——PBMC 需從不同供體獲取，供體免疫狀態(tài)差異會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定，且無法長期保存，難以建立標(biāo)準(zhǔn)化方法學(xué)。單核細(xì)胞系（如 HL-60、MM6、THP1）則克服了 PBMC 的局限：細(xì)胞來源穩(wěn)定（可批量培養(yǎng)），TLR 受體表達(dá)覆蓋主要亞型（如 HL-60 表達(dá) TLR1-TLR9），對熱原反應(yīng)重復(fù)性好，更適合商業(yè)化試劑盒與法規(guī)檢測。不同單核細(xì)胞系性能也有差異：MM6/IL-6 法檢測限約 0.05EU/mL，THP1/TNF-α 法因 TNF-α 為一級免疫效應(yīng)物檢測限更低，但 TNF-α 穩(wěn)定性差；HL-60/IL-6 法檢測限與穩(wěn)定性均優(yōu)于前兩者，成為主流選擇。湖州申科生物MAT試劑盒選用 HL-60 細(xì)胞系，正是基于其優(yōu)異的穩(wěn)定性與熱原響應(yīng)適配多場景，確保不同批次檢測結(jié)果一致。

革蘭氏陽性菌注射劑產(chǎn)品只依賴內(nèi)毒素檢測存在安全風(fēng)險(xiǎn)，需結(jié)合熱原檢測特性制定防控方案。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，而革蘭氏陽性菌可產(chǎn)生非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EPs），如脂磷壁酸，這類物質(zhì)同樣能引發(fā)人體發(fā)熱反應(yīng)，若只檢測內(nèi)毒素，可能遺漏 NEPs 污染，導(dǎo)致臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)。對此，風(fēng)險(xiǎn)評估需重點(diǎn)關(guān)注三點(diǎn)：一是建議開展家兔法與內(nèi)毒素檢測的一致性實(shí)驗(yàn)，對比兩種方法的檢測結(jié)果，排查是否存在內(nèi)毒素未檢出但家兔法陽性的情況；二是采用 MAT 法熱原檢測，其通過單核細(xì)胞活化機(jī)制，可同時(shí)識別內(nèi)毒素與 NEPs，若 MAT 法檢測陽性，需進(jìn)一步追溯 NEPs 來源；三是若無法排除 NEPs 風(fēng)險(xiǎn)，必須按藥典要求補(bǔ)充熱原檢測（如 MAT 法或家兔法），而非只依賴內(nèi)毒素檢測。尤其對于新藥或工藝變更后的產(chǎn)品，需通過多方法驗(yàn)證，確保熱原檢測覆蓋所有潛在致熱物質(zhì)，保障臨床用藥安全。

傳統(tǒng)熱原檢測方法的局限性十分明顯：鱟試驗(yàn)法只能特異性識別細(xì)菌內(nèi)毒素，對非內(nèi)毒素?zé)嵩耆珶o響應(yīng)；家兔熱原試驗(yàn)雖能篩查全類型熱原，但靈敏度低（檢測限≥5EU/kg），無法檢出微量非內(nèi)毒素?zé)嵩覠o法區(qū)分熱原類型，難以追溯污染源頭；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）的出現(xiàn)有效解決了上述難題，其關(guān)鍵優(yōu)勢在于：基于人源單核細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制，可同時(shí)識別所有具備生物活性的熱原（包括內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素），且檢測靈敏度高（對病毒熱原檢測限低至pg級）；檢測周期短（24-48小時(shí)），可滿足產(chǎn)品快速放行需求；能通過細(xì)胞因子濃度定量評估熱原活性，避免“無活性熱原”的誤判。

傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法識別革蘭氏陽性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非內(nèi)毒素?zé)嵩?，存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，部分樣品（如脂質(zhì)體、表面活性劑制劑）會(huì)因內(nèi)毒素吸附導(dǎo)致低內(nèi)毒素回收（LER），BET法難以準(zhǔn)確定量。MAT 法通過單核細(xì)胞表面的多種 TLR 受體（TLR1-TLR10），可識別不同類型熱原：TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA 與酵母多糖、TLR5 識別鞭毛蛋白、TLR3 識別病毒 dsRNA 等，實(shí)現(xiàn) “全熱原覆蓋”。湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT法）的驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，其對不同濃度非內(nèi)毒素?zé)嵩许憫?yīng)：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可檢測到 0.005-0.035EU/mL熱原活性，0.1-10μg/mL LTA 對應(yīng) 0.1-0.7EU/mL 熱原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配體）對應(yīng) 0.5-3.0EU/mL 熱原活性。此外，MAT法檢測的是熱原的生物活性（而非單純 LPS 含量），可避免 LER 導(dǎo)致的假陰性，為CGT等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品提供更有保障的熱原檢測方案。