上海漢遜酵母宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）多與細(xì)胞關(guān)鍵功能相關(guān)，像細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活及凋亡等，工藝過(guò)程中會(huì)通過(guò)細(xì)胞分泌，或因細(xì)胞死亡、裂解而釋放。生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，主要有三方面因素影響HCP的組成與豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下潛在HCP數(shù)量可能極多，且并非所有基因都會(huì)表達(dá)，部分基因的表達(dá)存在時(shí)間與條件差異；例如大腸桿菌約含4300個(gè)基因，不同工藝產(chǎn)物會(huì)經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，增加HCP的總數(shù)與生化復(fù)雜性。研究表明，大腸桿菌表達(dá)的蛋白存在數(shù)量差異，這可能是對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但85-90%有潛在免疫原性的HCP在不同發(fā)酵過(guò)程中均會(huì)出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體及輔助成分構(gòu)成的體系，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、瞬時(shí)及誘導(dǎo)表達(dá)；以大腸桿菌為例，常見(jiàn)的表達(dá)形式包括胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性包涵體形式，以及融合與非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品自身特性：純化過(guò)程中能去除99%以上的HCP，但仍有殘留HCP保留在產(chǎn)品中，這些殘留HCP可能與產(chǎn)品結(jié)合，隨產(chǎn)品一同完成純化。

定制化試劑盒之所以成為宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的優(yōu)先選擇，關(guān)鍵原因之一是其構(gòu)建的檢測(cè)體系更契合商業(yè)化生產(chǎn)中HCP工藝雜質(zhì)的控制需求。在HCP校準(zhǔn)品與HCP抗體這兩大關(guān)鍵試劑組分達(dá)標(biāo)后，定制化方法的建立與優(yōu)化會(huì)依托真實(shí)的純化中間品及原液樣品開(kāi)展——通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)條件提升對(duì)低濃度HCP的檢測(cè)靈敏度，從而滿足工藝驗(yàn)證與過(guò)程控制的需求。臨床三期階段需對(duì)生產(chǎn)工藝開(kāi)展系統(tǒng)驗(yàn)證，以保障其穩(wěn)定性與可重復(fù)性，而定制化HCPELISA檢測(cè)方法能更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)工藝中HCP的去除效果，為工藝驗(yàn)證提供堅(jiān)實(shí)支撐。過(guò)程控制環(huán)節(jié)，借助工藝特異型HCP ELISA檢測(cè)方法，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中的HCP水平，擁有更強(qiáng)的生產(chǎn)異常預(yù)警能力，能及時(shí)排查生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

為更優(yōu)管控工藝、保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)均要求提供所用宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)ELISA試劑盒的抗體覆蓋率數(shù)據(jù)。通常需開(kāi)展覆蓋率分析的場(chǎng)景主要有以下四類：①臨床II期后，若仍使用商品化試劑盒，需評(píng)估其抗體覆蓋率是否能持續(xù)滿足質(zhì)量監(jiān)控需求；②臨床III期及后續(xù)階段，若產(chǎn)品研究者開(kāi)發(fā)了平臺(tái)化或工藝專屬型HCP監(jiān)測(cè)方法，此類試劑盒使用前需評(píng)估其覆蓋率水平與商業(yè)化試劑盒覆蓋率水平的差異；③申報(bào)階段若未提交覆蓋率數(shù)據(jù)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)可能向企業(yè)提出補(bǔ)充提交的要求；④產(chǎn)品上市后，若發(fā)生生產(chǎn)場(chǎng)地變更、工藝變更、HCP分析方法變更等情況，研究者需評(píng)估變更前后抗體覆蓋率水平的差異，以及該差異對(duì)藥品質(zhì)量與安全性的影響。

依據(jù)美國(guó)藥典 1132 章節(jié)規(guī)定，HCPs 校準(zhǔn)品需具備代表性，能夠覆蓋實(shí)際產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中的 HCPs。結(jié)合 HCP 免疫檢測(cè)方法的使用目的與預(yù)期風(fēng)險(xiǎn)管理需求，為滿足工藝開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證需求，同時(shí)應(yīng)對(duì)下游工藝可能出現(xiàn)的異常失效或工藝變更情況，建議選用上游發(fā)酵工藝末端（如澄清處理后的工藝點(diǎn)）的樣本作為 HCPs 來(lái)源。實(shí)際制備時(shí)，可采用空細(xì)胞或空載細(xì)胞，在模擬實(shí)際工藝的預(yù)設(shè)條件下采集樣本，再通過(guò)二維電泳、高分辨率質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)模擬工藝與實(shí)際工藝下 HCPs 的代表性開(kāi)展表征分析。越靠近下游工藝，HCPs 的蛋白種類越少，雖更接近成品（DS）中的 HCPs，但這類樣本可能無(wú)法滿足工藝開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證需求，也難以覆蓋工藝潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此通常不推薦使用，或只作為上游工藝 HCPs 免疫檢測(cè)方法的輔助材料。

由于 HCPs 屬于復(fù)雜的多分析物，為制備覆蓋率盡可能高的抗體（以覆蓋工藝特有的高風(fēng)險(xiǎn) HCPs），需采用可靠的免疫策略。獲得符合性能要求的抗體后，需借助經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的 2D 或 LC-MS 方法對(duì)抗體覆蓋率進(jìn)行表征，確?？贵w可充分覆蓋各實(shí)際工藝下產(chǎn)生的 HCPs。在擁有代表性抗原與優(yōu)良性能抗體的基礎(chǔ)上，開(kāi)展 ELISA 檢測(cè)體系開(kāi)發(fā)，涵蓋原輔料篩選與制備研究、各組分工藝及反應(yīng)體系研究、穩(wěn)定性研究等重要內(nèi)容。檢測(cè)體系開(kāi)發(fā)完成后，需依據(jù) ICH 及藥典要求開(kāi)展分析方法驗(yàn)證評(píng)估，確保體系的線性、范圍、檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性及耐用性均滿足法規(guī)要求。

湖州申科生物專注于提供契合嚴(yán)苛法規(guī)要求的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA 檢測(cè)試劑盒，主要目標(biāo)是滿足抗體藥、疫苗等生物制品在 IND/BLA 申報(bào)階段的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，公司搭建了全流程依規(guī)開(kāi)發(fā)的質(zhì)量管控體系 —— 整個(gè)開(kāi)發(fā)過(guò)程嚴(yán)格遵循 ISO 13485 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)能充分滿足用戶審計(jì)需求，從體系層面保障產(chǎn)品合規(guī)性。其開(kāi)發(fā)流程包含三大關(guān)鍵階段，前兩大基礎(chǔ)階段聚焦關(guān)鍵物料的品質(zhì)把控：一是 HCP 殘留定量檢測(cè)參考品開(kāi)發(fā)，重點(diǎn)是構(gòu)建可靠的 HCP 抗原參考品，需完成抗原表征、量值溯源與賦值、均一性驗(yàn)證及穩(wěn)定性考察等工作，為檢測(cè)準(zhǔn)確性與樣品代表性奠定基礎(chǔ)；二是高質(zhì)量大批量抗體制備，通過(guò)優(yōu)化的 HCP 抗原動(dòng)物免疫策略，搭配嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目贵w質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（含標(biāo)準(zhǔn)制定、覆蓋率驗(yàn)證）與穩(wěn)定的制備工藝，生產(chǎn)出高特異性、廣覆蓋度的檢測(cè)抗體，確保后續(xù)檢測(cè)的特異性與靈敏度。