上海醫(yī)療器械熱原檢測風(fēng)險(xiǎn)評估

MAT 法熱原檢測標(biāo)曲采用非倍比稀釋，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀釋，主要優(yōu)勢在于提升標(biāo)曲準(zhǔn)確性與適用性，避免稀釋誤差影響。一是可密集覆蓋關(guān)鍵濃度區(qū)間：熱原檢測的重點(diǎn)關(guān)注區(qū)為低濃度拐點(diǎn)（如 0.0125-0.1EU/mL）與高濃度平臺區(qū)（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀釋可在這些區(qū)間設(shè)置更多濃度點(diǎn)（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲線擬合精度，而倍比稀釋低濃度點(diǎn)少，易導(dǎo)致低濃度熱原定量不準(zhǔn)。二是降低稀釋誤差累積：倍比稀釋需連續(xù)稀釋（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步誤差會累積，導(dǎo)致低濃度點(diǎn)實(shí)際濃度偏離理論值；非倍比稀釋通過單獨(dú)配制每個濃度點(diǎn)（如直接用標(biāo)準(zhǔn)品配制 0.025EU/mL），避免誤差累積，提升標(biāo)曲可靠性。三是適配不同樣品濃度：非倍比稀釋可根據(jù)樣品預(yù)期濃度調(diào)整標(biāo)曲范圍，如樣品預(yù)期濃度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 點(diǎn)，確保樣品濃度落在標(biāo)曲線性區(qū)，而倍比稀釋范圍固定，靈活性差。這些優(yōu)勢使非倍比稀釋成為 MAT 法標(biāo)曲配制的優(yōu)先選擇方式。

熱原是能引發(fā)恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)總稱，主要成分為細(xì)菌內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS），同時涵蓋病毒、真菌毒素、支原體等非內(nèi)毒素?zé)嵩錂z測是保障藥品與醫(yī)療器械安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)前熱原檢測已形成 “特異性檢測 + 廣譜篩查” 互補(bǔ)的完整體系：以鱟試驗(yàn)法（含天然 LAL 與重組 rCR/rFC 試劑）作為細(xì)菌內(nèi)毒素的特異性檢測手段，憑借 fg 級靈敏度成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法，可通過凝膠法實(shí)現(xiàn)定性、動態(tài)濁度 / 顯色法完成定量；以家兔熱原試驗(yàn)作為傳統(tǒng)廣譜篩查方法，雖操作繁瑣（需預(yù)試篩選基礎(chǔ)體溫穩(wěn)定家兔，正式試驗(yàn)觀察 3 小時體溫變化），但仍是放射性質(zhì)的藥物、血液制品等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品排除非內(nèi)毒素?zé)嵩难a(bǔ)充手段；以單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）作為新興全熱原檢測技術(shù)，利用人源單核細(xì)胞（如 THP-1 細(xì)胞）釋放 IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子的特性，可同時識別內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩鹾弦呙?、基因治療產(chǎn)品等對風(fēng)險(xiǎn)控制的需求。三種方法協(xié)同應(yīng)用，從原料入廠到成品放行構(gòu)建全流程熱原防控網(wǎng)絡(luò)，既保證對內(nèi)毒素的準(zhǔn)確監(jiān)控，又避免非內(nèi)毒素?zé)嵩倪z漏風(fēng)險(xiǎn)。

相較于傳統(tǒng)家兔法，熱原檢測MAT法在動物福利、檢測性能、適用范圍等方面具有明顯優(yōu)勢。從動物福利看，MAT法使用分離培養(yǎng)的單核細(xì)胞系（如湖州申科 HL-60 細(xì)胞系），無需動物，完全符合 “減少、替代、優(yōu)化” 的 3R 原則，規(guī)避家兔法的倫理爭議與飼養(yǎng)成本。檢測性能上，家兔法只能定性且靈敏度低（檢測限≥5EU/kg），結(jié)果受動物個體差異、環(huán)境溫度影響大；MAT 法可定量檢測，標(biāo)曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，檢測限（LOD）達(dá) 0.0125EU/mL，批間 CV≤25%，重復(fù)性更優(yōu)。適用范圍方面，家兔法不適用于放射性質(zhì)藥物、基因療法制劑等可能影響動物體溫的產(chǎn)品；MAT法適配疫苗、血制品、抗體藥、化藥等幾乎所有類型樣品，且支持高通量檢測，單塊 96 孔板可同時分析多個樣品，檢測時間從家兔法的3-7天縮短至1.5天，大幅提升效率。

MAT 試劑盒熱原檢測配套細(xì)胞的質(zhì)量控制，是保障檢測結(jié)果可靠的重要環(huán)節(jié)，需從功能、安全性、穩(wěn)定性三方面建立體系。在功能鑒定上，按歐洲 MAT 法要求，需檢測細(xì)胞的 Toll 樣受體（TLR1-TLR9）表達(dá)情況—確保細(xì)胞能響應(yīng)不同類型熱原（如 TLR4 響應(yīng) LPS、TLR2/6 響應(yīng)脂磷壁酸）；同時考察細(xì)胞倍增時間（確?；钚苑€(wěn)定）、熱原反應(yīng)性（對標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩男盘枏?qiáng)度），確保細(xì)胞具備熱原識別與炎癥因子分泌能力。在安全性檢測上，需驗(yàn)證細(xì)胞無菌（無細(xì)菌、真菌污染）、無支原體、無外源病毒因子（如 HIV、HBV）及分枝桿菌，避免外源污染影響檢測結(jié)果。在穩(wěn)定性考察上，需監(jiān)測不同代次細(xì)胞的熱原刺激敏感性，一般要求細(xì)胞使用代次不超過 20 代，代次過高會導(dǎo)致 TLR 表達(dá)下降、炎癥因子分泌減少，影響檢測靈敏度。湖州申科的配套細(xì)胞還額外通過 Western blot 驗(yàn)證 TLR 受體表達(dá)量，并用不同非內(nèi)毒素?zé)嵩潴w刺激驗(yàn)證響應(yīng)性，形成全維度質(zhì)量控制，確保細(xì)胞適配熱原檢測需求。

中國藥典與歐洲藥典對 MAT 熱原檢測的細(xì)胞類型及復(fù)孔數(shù)有明確要求，且存在細(xì)節(jié)差異。細(xì)胞類型上，兩者均認(rèn)可人全血、PBMC（外周血單個核細(xì)胞，至少 4 個供體，歐洲藥典建議 8 個供體），中國藥典明確將單核細(xì)胞系納入，歐洲藥典則要求單核細(xì)胞系需做支原體污染檢測、細(xì)胞鑒別等；檢測方法均為 “熱原刺激細(xì)胞 + ELISA 檢測 IL-6/IL-1β/TNF-α”。復(fù)孔數(shù)方面，兩者均規(guī)定平行孔≥4、濃度點(diǎn)≥4，中國藥典額外要求標(biāo)曲 r≥0.90，主要目的是通過多重復(fù)孔抵消 PBMC 的不穩(wěn)定性，確保熱原檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。