山東熱原檢測體系

來源： 發(fā)布時間：2025-11-26

基于單核細胞系的穩(wěn)定性，MAT 熱原檢測可將復孔數(shù)從藥典要求的≥4 降至≥3。PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒數(shù)據(jù)顯示，單核細胞系標曲的 4 復孔與 3 復孔，各濃度點（0.0125-1.0EU/mL）的準確度（相對偏差）與精密度均在標準范圍內，無明顯差異。這一調整的主要依據(jù)是單核細胞系消除了 PBMC 的異質性，無需依賴多復孔抵消波動，既能滿足熱原檢測的穩(wěn)定性與統(tǒng)計學合理性要求，又能減少試劑與耗材消耗，降低檢測成本，同時提升實驗效率。因此樣品預測試時可選擇3復孔進行初步檢測，產(chǎn)品放行還需按照藥典要求進行4復孔測試。
MAT 法通過熱原活化單核細胞 TLR 受體，釋放 IL-6 等細胞因子，ELISA 檢測 IL-6 推算熱原含量。山東熱原檢測體系

山東熱原檢測體系,熱原檢測

PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒以 “簡化流程、提升效率” 為設計理念，采用即用型細胞，凍存細胞無需離心復蘇培養(yǎng)，復融后可直接與供試品混合共孵育，大幅節(jié)省傳統(tǒng)細胞預處理（如調整細胞狀態(tài)、鋪板培養(yǎng)）的時間成本。實驗流程清晰可控：只需按要求制備待測供試品與內毒素工作標準品，各取對應體積加入細胞懸液（每孔加樣量明確），經(jīng) 37℃、5% CO?孵育 24 小時后，離心收集上清并通過 ELISA 法檢測 IL-6 含量，全程可在 24 小時內獲得穩(wěn)定可靠的檢測結果。這種便捷性尤其適配實驗室高通量檢測需求，減少人員操作步驟的同時，降低了因復雜操作引入的誤差風險，兼顧效率與準確性。
上海熱原檢測合規(guī)申報單核細胞活化反應試驗（MAT）利用人源細胞釋放IL-6等因子，可同時檢出病毒、真菌等非內毒素熱原。

山東熱原檢測體系,熱原檢測

MAT法（單核細胞活化反應測定）熱原檢測基于人體免疫反應機制設計，原理是：內毒素（革蘭氏陰性菌來源）與非內毒素熱原（革蘭氏陽性菌、霉菌、病毒等來源）進入人體后，會活化單核細胞或單核細胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子。檢測時將供試品與單核細胞 / 單核細胞系共孵育，再通過 ELISA 定量檢測釋放的 IL-6 含量，結合內毒素標準品繪制的標曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規(guī)定，實現(xiàn)內毒素與非內毒素熱原的全覆蓋檢測。

傳統(tǒng)細菌內毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法識別革蘭氏陽性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非內毒素熱原，存在漏檢風險；同時，部分樣品（如脂質體、表面活性劑制劑）會因內毒素吸附導致低內毒素回收（LER），BET法難以準確定量。MAT 法通過單核細胞表面的多種 TLR 受體（TLR1-TLR10），可識別不同類型熱原：TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA 與酵母多糖、TLR5 識別鞭毛蛋白、TLR3 識別病毒 dsRNA 等，實現(xiàn) “全熱原覆蓋”。湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT法）的驗證數(shù)據(jù)顯示，其對不同濃度非內毒素熱原均有響應：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可檢測到 0.005-0.035EU/mL熱原活性，0.1-10μg/mL LTA 對應 0.1-0.7EU/mL 熱原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配體）對應 0.5-3.0EU/mL 熱原活性。此外，MAT法檢測的是熱原的生物活性（而非單純 LPS 含量），可避免 LER 導致的假陰性，為CGT等高風險產(chǎn)品提供更有保障的熱原檢測方案。
PBMC（外周血單個核細胞）用于 MAT 檢測時供體差異大，IL-6 釋放波動明顯，標準化難度高于單核細胞系。

山東熱原檢測體系,熱原檢測

MAT 法熱原檢測背景值偏高會干擾結果判讀，需從試劑、操作兩方面解決。試劑相關問題中，非特異性活化（如試劑含微量熱原）會導致細胞異常分泌 IL-6，需選用低內毒素的試劑與耗材；檢測試劑添加過多（如抗體濃度過高）會增加非特異性結合，需按說明書稀釋試劑或降低推薦濃度。操作環(huán)節(jié)問題更多見：孔洗滌不充分會殘留未結合抗體與酶，需按方案完成規(guī)定洗滌次數(shù)（如 3-5 次），確保洗滌液充分浸潤孔底；洗滌緩沖液污染（如滋生微生物）會引入外源信號，需現(xiàn)配現(xiàn)用緩沖液；加終止液后讀板延遲（超 10 分鐘），會因黃色產(chǎn)物降解導致背景虛高，需加終止液后立即讀板；底物孵育時見光會引發(fā)非特異性顯色，需在避光環(huán)境下進行 TMB 孵育；孔板底部臟（如殘留指紋、液體痕跡）會影響光吸收，需用無塵紙清潔孔板底部后再讀板。通過以上措施，可有效降低背景值，確保檢測信號的真實性，避免因背景干擾導致熱原濃度誤判。
熱原有廣譜來源特征，革蘭陰性菌（內毒素/LPS）致熱能力強，革蘭陽性菌、真菌、病毒均可產(chǎn)生。非動物源熱原檢測結果判定

在藥品安全語境中，熱原特指細菌性熱原—微生物代謝產(chǎn)物、細菌尸體及內毒素的統(tǒng)稱。山東熱原檢測體系

MAT 試劑盒配套的即用型細胞存在明確的傳代限制，且商業(yè)化傳代需獲得授權，關鍵是保障細胞質量與檢測可靠性。首先，即用型細胞經(jīng)特殊工藝優(yōu)化，已處于較好的活性與熱原響應狀態(tài)，不適合傳代，傳代后細胞會出現(xiàn) TLR 受體表達下降、炎癥因子分泌減少等問題，導致熱原檢測靈敏度降低，如 HL-60 細胞傳代超過 5 代后，IL-6 分泌量下降 30%，無法滿足檢測要求。其次，若用戶需將即用型細胞用于商業(yè)化生產(chǎn)（如大規(guī)模檢測），需獲得湖州申科授權，包括用戶資質審核、技術培訓、傳代方案驗證，確保用戶具備細胞培養(yǎng)與質量控制能力，避免未經(jīng)授權傳代導致細胞特性改變，影響檢測結果一致性。此外，參考文獻數(shù)據(jù)，即使是可傳代的單核細胞系，使用代次也不超過 20 代，超過后代次細胞穩(wěn)定性差，因此即用型細胞設計為 “一次性使用”，從源頭避免傳代帶來的風險。用戶需嚴格遵守傳代限制，若需長期使用，建議定期采購新批次試劑盒，確保細胞質量。
山東熱原檢測體系