PG13宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測抗體覆蓋率驗(yàn)證

由于宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測試劑盒關(guān)鍵組分（校準(zhǔn)品、檢測抗體）存在固有且明顯的變異度，不同試劑盒對同一樣本的檢測結(jié)果，不僅可能在數(shù)值上出現(xiàn)較大差距，在特定 HCP（如低豐度或高風(fēng)險(xiǎn) HCP）的檢出能力上，也可能存在明顯偏差，這對生物制品 HCP 殘留的準(zhǔn)確管控構(gòu)成挑戰(zhàn)。因此，為確保檢測結(jié)果能真實(shí)反映自身產(chǎn)品的 HCP 殘留狀況，企業(yè)必須結(jié)合自身產(chǎn)品特性（如宿主細(xì)胞類型、目標(biāo)產(chǎn)物屬性）與生產(chǎn)工藝特點(diǎn)，對不同品牌、不同類型的試劑盒開展系統(tǒng)且詳細(xì)的平行比對實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，還需進(jìn)行針對性的適用性評(píng)估，驗(yàn)證試劑盒對自身產(chǎn)品的檢測準(zhǔn)確性、特異性及穩(wěn)定性，再篩選出與自身產(chǎn)品匹配度適合的檢測方案，為生物制品的 HCP 殘留控制提供可靠技術(shù)支撐，保障產(chǎn)品質(zhì)量與用藥安全。

湖州申科運(yùn)用免疫磁珠分離技術(shù)（IMBS），搭配 2D 電泳或 LC-MS 技術(shù)評(píng)估抗體覆蓋率。IMBS 的主要流程涵蓋：多克隆抗體與磁珠的偶聯(lián)反應(yīng)、磁珠未結(jié)合位點(diǎn)的封閉處理、HCP 樣本與結(jié)合抗體的磁珠共同孵育反應(yīng)。該過程中，HCP 抗體會(huì)結(jié)合可識(shí)別的 HCP，未被識(shí)別的 HCP 則通過后續(xù)洗滌步驟去除，隨后借助低 pH 等洗脫條件，收集抗體捕獲的 HCP。此方法具備 AAE（抗體親和提取，Antibody Affinity Extraction）免疫層析柱分離的全部優(yōu)勢，同時(shí)免疫磁珠可在懸浮狀態(tài)下與 HCP 樣品充分混勻并結(jié)合，HCP 結(jié)合效果更優(yōu)；且依托磁珠吸附，能減少 HCP 與填料的非特異性吸附，進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

依據(jù)美國藥典 1132 章節(jié)規(guī)定，HCPs 校準(zhǔn)品需具備代表性，能夠覆蓋實(shí)際產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中的 HCPs。結(jié)合 HCP 免疫檢測方法的使用目的與預(yù)期風(fēng)險(xiǎn)管理需求，為滿足工藝開發(fā)、驗(yàn)證需求，同時(shí)應(yīng)對下游工藝可能出現(xiàn)的異常失效或工藝變更情況，建議選用上游發(fā)酵工藝末端（如澄清處理后的工藝點(diǎn)）的樣本作為 HCPs 來源。實(shí)際制備時(shí)，可采用空細(xì)胞或空載細(xì)胞，在模擬實(shí)際工藝的預(yù)設(shè)條件下采集樣本，再通過二維電泳、高分辨率質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對模擬工藝與實(shí)際工藝下 HCPs 的代表性開展表征分析。越靠近下游工藝，HCPs 的蛋白種類越少，雖更接近成品（DS）中的 HCPs，但這類樣本可能無法滿足工藝開發(fā)與驗(yàn)證需求，也難以覆蓋工藝潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此通常不推薦使用，或只作為上游工藝 HCPs 免疫檢測方法的輔助材料。

磷脂酶 B 樣蛋白 2（Phospholipase B-Like 2，PLBL2/PLBD2），憑借強(qiáng)共純化能力、高免疫原性及潛在酶活性，被認(rèn)定為 CHO 宿主細(xì)胞蛋白（HCP）中的關(guān)鍵高風(fēng)險(xiǎn)因子之一。當(dāng)前行業(yè)建議，需針對性開發(fā)特定檢測方法，對這類已知或特定蛋白進(jìn)行監(jiān)控，以更有效把控其潛在風(fēng)險(xiǎn)。SHENTEK^® CHO PLBL-2 殘留檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）由湖州申科生物自主研發(fā)，擁有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，是一款 CHO PLBL-2 蛋白通用檢測試劑盒。該試劑盒適用于對 CHO 表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的生物制品中，CHO HCP 高風(fēng)險(xiǎn)蛋白 PLBL-2 進(jìn)行定量檢測，且操作步驟少、檢測快速，兼具強(qiáng)檢測專一性與穩(wěn)定可靠的性能。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）的來源中，常伴隨核酸、胞膜脂類及培養(yǎng)基中的氨基酸等非HCP成分，這些成分會(huì)干擾總蛋白檢測的準(zhǔn)確性，因此在檢測前需開展純化前處理，同時(shí)對總蛋白檢測方法實(shí)施方法學(xué)確認(rèn)。HCP本身屬于多蛋白混合物，不同總蛋白定量方法的檢測結(jié)果會(huì)存在一定差異，這也是造成HCP免疫檢測方法結(jié)果不一致的原因之一。若不同HCP蛋白定量方法的檢測結(jié)果差異較大，通常需同時(shí)采用2種及以上經(jīng)確認(rèn)的方法進(jìn)行檢測，隨后取平均值?？偟鞍讬z測方法的定量限通常只能達(dá)到μg/mL級(jí)別，而HCP檢測試劑盒的產(chǎn)品校準(zhǔn)品濃度則處于ng/mL級(jí)別。將HCP高濃度原液稀釋至低濃度產(chǎn)品校準(zhǔn)品的過程中會(huì)產(chǎn)生稀釋誤差，因此需對產(chǎn)品校準(zhǔn)品重新進(jìn)行標(biāo)定賦值。編輯分享用多種方法確認(rèn)檢測結(jié)果時(shí)，如何選擇合適的方法組合？總蛋白檢測定量限與HCP校準(zhǔn)品濃度差異大的原因是什么？有哪些方法可以降低非HCP成分對檢測的干擾？

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）多與細(xì)胞關(guān)鍵功能相關(guān)，像細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活及凋亡等，工藝過程中會(huì)通過細(xì)胞分泌，或因細(xì)胞死亡、裂解而釋放。生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，主要有三方面因素影響HCP的組成與豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下潛在HCP數(shù)量可能極多，且并非所有基因都會(huì)表達(dá)，部分基因的表達(dá)存在時(shí)間與條件差異；例如大腸桿菌約含4300個(gè)基因，不同工藝產(chǎn)物會(huì)經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，增加HCP的總數(shù)與生化復(fù)雜性。研究表明，大腸桿菌表達(dá)的蛋白存在數(shù)量差異，這可能是對環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但85-90%有潛在免疫原性的HCP在不同發(fā)酵過程中均會(huì)出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體及輔助成分構(gòu)成的體系，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、瞬時(shí)及誘導(dǎo)表達(dá)；以大腸桿菌為例，常見的表達(dá)形式包括胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性包涵體形式，以及融合與非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品自身特性：純化過程中能去除99%以上的HCP，但仍有殘留HCP保留在產(chǎn)品中，這些殘留HCP可能與產(chǎn)品結(jié)合，隨產(chǎn)品一同完成純化。