Sf9宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測常見問題分析

昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（IC-BEVS）是以桿狀病毒作為外源基因載體，以昆蟲細(xì)胞作為宿主進(jìn)行外源蛋白生產(chǎn)的真核表達(dá)系統(tǒng)。BVES具有易于規(guī)?；a(chǎn)、培養(yǎng)成本低、生物安全性高等優(yōu)勢，近年來陸續(xù)被研究用于生產(chǎn)重組蛋白、rAAV載體、亞單位疫苗（如病毒樣顆粒（VLP）疫苗）等， 在生物制品重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域已有普遍運(yùn)用。Sf9來源于草地夜蛾細(xì)胞系（Spodoptera frugiperda cell line，Sf），是目前較常用的昆蟲細(xì)胞系之一。SHENTEK® Sf9 HCP殘留蛋白檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法），可定量檢測使用Sf9細(xì)胞系生產(chǎn)的生物制品中宿主細(xì)胞蛋白的殘留檢測。試劑盒抗體覆蓋率為70.4%-96.0%（IMBS-2D）和91.2% (IMBS-MS，Unique Peptide ≥2）。

湖州申科生物在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA 檢測技術(shù)領(lǐng)域具備扎實(shí)的技術(shù)積累，已搭建起高質(zhì)量、全流程的自主開發(fā)平臺，覆蓋 HCP 檢測試劑盒研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①抗原表征與制備：依托合規(guī)平臺具備 HCP Reference/Antigen 制備能力，借助 2D 凝膠電泳等先進(jìn)技術(shù)保障抗原庫的代表性；②動物免疫與抗體制備：憑借自有免疫動物平臺，把控免疫原設(shè)計(jì)及動物免疫過程，產(chǎn)出高特異性、廣覆蓋度的抗體；③體系開發(fā)與驗(yàn)證：依靠成熟技術(shù)經(jīng)驗(yàn)開發(fā)高靈敏度、高穩(wěn)定性的檢測體系，并嚴(yán)格遵循 GMP 標(biāo)準(zhǔn)完成方法學(xué)驗(yàn)證。該平臺通過全流程自主可控的技術(shù)整合，從源頭保障試劑盒性能的一致性與可靠性，大幅降低不同批次試劑盒的檢測變異性。其研發(fā)的 HCP ELISA 試劑盒已服務(wù)國內(nèi)外 200 余家生物醫(yī)藥企業(yè)，為單抗、疫苗等生物制品的工藝開發(fā)、質(zhì)量控制及 IND/BLA 等法規(guī)申報(bào)，提供符合監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)的定制化檢測方案。

湖州申科生物致力于開發(fā)接近實(shí)際工藝的商業(yè)化宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測試劑盒，通過不同工藝的HCP差異化分析，針對性輸出不同細(xì)分工藝領(lǐng)域的HCP檢測試劑盒。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：針對CHO-S與CHO-K1兩種宿主細(xì)胞，二者共享2458種共同HCP（占比79.7%），但分別存在392種與236種特異HCP，凸顯工藝差異導(dǎo)致的殘留蛋白特異性。進(jìn)一步對比B3表達(dá)菌與K2克隆菌，二者雖共享1489種相同蛋白（占比88%和85%），但仍分別檢出208種和258種獨(dú)有蛋白，差異率達(dá)12%-15%。這些發(fā)現(xiàn)直接驗(yàn)證不同工藝路線與克隆選擇會影響HCP殘留譜的組成。因此，湖州申科提出"工藝定制化檢測"策略——通過準(zhǔn)確識別共性及特異HCP，針對性開發(fā)細(xì)分試劑盒產(chǎn)品。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）多與細(xì)胞關(guān)鍵功能相關(guān)，例如細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活及凋亡等，在生產(chǎn)工藝中會因細(xì)胞分泌、死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過程里，有三大因素主要影響 HCP 的組成與豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在 HCP 數(shù)量可能極多，且并非所有基因都會表達(dá)，部分基因的表達(dá)具有時(shí)間和條件特異性；像大腸桿菌約含 4300 個基因，不同工藝產(chǎn)物會經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，這增加了 HCP 的總數(shù)與生化復(fù)雜性。研究顯示，大腸桿菌表達(dá)的蛋白間存在數(shù)量差異，這種差異可能是對環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但 85-90% 具有潛在免疫原性的 HCP 在不同發(fā)酵過程中均會出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體及輔助成分構(gòu)成的體系，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、瞬時(shí)及誘導(dǎo)表達(dá)；以大腸桿菌為例，常見表達(dá)形式包括胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性包涵體形式，還有融合與非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品自身特性的影響：純化過程中能去除 99% 以上的 HCP，但仍有少量殘留 HCP 留在產(chǎn)品中，這些殘留 HCP 可能與產(chǎn)品結(jié)合，隨產(chǎn)品一同被純化。

全球快速增長的抗體、蛋白類藥物等生物藥由相應(yīng)工程細(xì)胞生產(chǎn)。生物制品藥物生產(chǎn)過程中的宿主內(nèi)源性蛋白，被稱為宿主細(xì)胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）會隨著不同工藝流程部分殘留在藥物中。宿主細(xì)胞殘留蛋白作為外源蛋白可能會在不同程度上引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致過敏反應(yīng)或其它不良反應(yīng)；另外還有一些殘留HCPs具有蛋白酶或脂酶的活性，可能導(dǎo)致蛋白藥物或輔料的降解，進(jìn)而增加藥物產(chǎn)品的質(zhì)量和療效的不穩(wěn)定性?；诖?，對藥物中HCPs的定性與定量檢測就顯得尤為重要。全球各國藥典如美國藥典，歐洲藥典以及中國藥典都對HCPs檢測提出了具體要求和標(biāo)準(zhǔn)。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）是生物制品中源自細(xì)胞基質(zhì)的殘留雜質(zhì)，異質(zhì)性特征明顯。其復(fù)雜性主要體現(xiàn)在三方面：①理化特性差異：包含胞內(nèi)與分泌蛋白（涉及關(guān)鍵生理功能），等電點(diǎn)（pI 3-11）、分子量（5-250kDa）及疏水性的區(qū)間跨度大；②上游工藝影響：不同發(fā)酵工藝（如細(xì)胞株選擇、培養(yǎng)條件控制）會誘導(dǎo)獨(dú)特的翻譯后修飾（PTM），進(jìn)而增加 HCP 的總量與生化復(fù)雜性；③下游工藝與產(chǎn)物特性干擾：抗體、細(xì)胞因子等重組蛋白或病毒類藥物的純化工藝，會選擇性殘留特定 HCP；同時(shí)，產(chǎn)物形式（如大腸桿菌的包涵體 / 可溶性表達(dá)）也會直接影響 HCP 的殘留譜。針對特定生產(chǎn)工藝開發(fā)定制化檢測方案，是準(zhǔn)確監(jiān)控 HCP 殘留的關(guān)鍵所在。