北京疫苗熱原檢測(cè)流程

PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）的供體差異會(huì)直接導(dǎo)致熱原檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)，主要體現(xiàn)在 IL-6 釋放水平的不一致。不同供體的 PBMC，其單核細(xì)胞比例、TLR 受體表達(dá)量、免疫活性狀態(tài)存在差異：有的供體 PBMC 受熱原刺激后， IL-6 釋放量高；有的則極低，甚至無(wú)明顯響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示， PBMC 的標(biāo)曲各濃度點(diǎn)相對(duì)偏差有高達(dá) 171.43%的，正是這種差異的體現(xiàn)，導(dǎo)致熱原檢測(cè)結(jié)果難以標(biāo)準(zhǔn)化，無(wú)法準(zhǔn)確判斷供試品熱原是否超標(biāo)，從而增加了藥品的質(zhì)量控制風(fēng)險(xiǎn)。

MAT法熱原檢測(cè)中，樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)需嚴(yán)格控制，以保障炎癥因子分泌量穩(wěn)定。說(shuō)明書要求共培養(yǎng) 24 小時(shí)，雖未明確允差，但實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，±30 分鐘的允差對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響 —— 細(xì)胞因子（如 IL-6）分泌具有時(shí)間依賴性，24 小時(shí)左右達(dá)到分泌平臺(tái)期，半小時(shí)差異不會(huì)導(dǎo)致分泌量大幅波動(dòng)。若實(shí)驗(yàn)室對(duì)結(jié)果穩(wěn)定性要求極高（如 QC 放行檢測(cè)），建議嚴(yán)格按 24 小時(shí)操作，避免因時(shí)長(zhǎng)差異引入誤差；若為預(yù)實(shí)驗(yàn)（如樣品稀釋倍數(shù)摸索），±30 分鐘允差可接受，但需在記錄中注明實(shí)際培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。需注意的是，共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)不可超過(guò) 26 小時(shí)或短于 22 小時(shí)：過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性下降（炎癥因子分泌減少），過(guò)短則未達(dá)分泌平臺(tái)期（檢測(cè)信號(hào)偏低），均可能導(dǎo)致熱原濃度低估。此外，培養(yǎng)環(huán)境需保持穩(wěn)定（37℃、5% CO?），溫度波動(dòng)會(huì)影響細(xì)胞代謝，間接導(dǎo)致共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的實(shí)際效果偏離，因此需定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度，確保環(huán)境條件一致。

相較于傳統(tǒng)家兔法，熱原檢測(cè)MAT法在動(dòng)物福利、檢測(cè)性能、適用范圍等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。從動(dòng)物福利看，MAT法使用分離培養(yǎng)的單核細(xì)胞系（如湖州申科 HL-60 細(xì)胞系），無(wú)需動(dòng)物，完全符合 “減少、替代、優(yōu)化” 的 3R 原則，規(guī)避家兔法的倫理爭(zhēng)議與飼養(yǎng)成本。檢測(cè)性能上，家兔法只能定性且靈敏度低（檢測(cè)限≥5EU/kg），結(jié)果受動(dòng)物個(gè)體差異、環(huán)境溫度影響大；MAT 法可定量檢測(cè)，標(biāo)曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，檢測(cè)限（LOD）達(dá) 0.0125EU/mL，批間 CV≤25%，重復(fù)性更優(yōu)。適用范圍方面，家兔法不適用于放射性質(zhì)藥物、基因療法制劑等可能影響動(dòng)物體溫的產(chǎn)品；MAT法適配疫苗、血制品、抗體藥、化藥等幾乎所有類型樣品，且支持高通量檢測(cè)，單塊 96 孔板可同時(shí)分析多個(gè)樣品，檢測(cè)時(shí)間從家兔法的3-7天縮短至1.5天，大幅提升效率。

熱原檢測(cè)技術(shù)自 20 世紀(jì)初問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)歷了 “動(dòng)物試驗(yàn)→體外生化檢測(cè)→細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)” 的三次關(guān)鍵變革，每一次變革均推動(dòng)檢測(cè)效率、準(zhǔn)確性與全面性的提升。20 世紀(jì)初至中期，熱原檢測(cè)方法只有家兔熱原試驗(yàn)，通過(guò)觀察家兔體溫變化篩查熱原，雖實(shí)現(xiàn)了廣譜檢測(cè)，但存在動(dòng)物成本高、操作繁瑣、靈敏度低、種屬差異大等局限，難以滿足制藥行業(yè)快速發(fā)展需求。20 世紀(jì) 60 年代，鱟試驗(yàn)法（LAL 法）的發(fā)明開(kāi)啟了熱原檢測(cè)的 “體外生化時(shí)代”，利用鱟血變形細(xì)胞裂解物的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，靈敏度提升至 ng 級(jí)，檢測(cè)時(shí)間縮短至 1-2 小時(shí)，迅速成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法；但該方法依賴鱟資源，易受 β- 葡聚糖干擾，且只能檢測(cè)內(nèi)毒素，無(wú)法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩?1 世紀(jì)以來(lái)，重組技術(shù)與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)熱原檢測(cè)進(jìn)入 “全熱原管控時(shí)代”：重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）與重組 C 因子試劑（rFC）通過(guò)基因工程技術(shù)制備，擺脫對(duì)鱟資源的依賴，消除葡聚糖干擾，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定（MAT）利用人源單核細(xì)胞檢測(cè)全類型熱原，填補(bǔ)非內(nèi)毒素?zé)嵩瓩z測(cè)空白，且結(jié)果更貼近人體實(shí)際反應(yīng)。

熱原檢測(cè)MAT法的法規(guī)地位持續(xù)提升，已成為多國(guó)藥典認(rèn)可的熱原檢測(cè)替代方法。歐洲藥典（EP）是推動(dòng) MAT 應(yīng)用的關(guān)鍵力量：通則 2.6.30 明確 MAT 可替代家兔熱原試驗(yàn)（RPT），且能同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?024 年歐洲藥典委員會(huì)批準(zhǔn)刪除所有條款中的家兔法，修訂文本將于 2025 年7月1日生效，強(qiáng)制鼓勵(lì)使用 MAT 等體外替代方法。美國(guó)藥典（USP）<151> 規(guī)定，經(jīng)驗(yàn)證的體外熱原試驗(yàn)（如 MAT）可替代家兔法，且需依據(jù) USP<1225>開(kāi)展驗(yàn)證；FDA 行業(yè)指南進(jìn)一步明確 MAT 的合規(guī)性。中國(guó)藥典 2020 年版通則 9301 將 MAT 列為熱原檢查的補(bǔ)充方法，雖暫未替代家兔法，但明確其適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的全熱原篩查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)也優(yōu)先推薦體外熱原檢測(cè)模型，全球法規(guī)協(xié)同推動(dòng) MAT 成為熱原檢測(cè)的主流技術(shù)。

中國(guó)藥典與歐洲藥典對(duì) MAT 熱原檢測(cè)的細(xì)胞類型及復(fù)孔數(shù)有明確要求，且存在細(xì)節(jié)差異。細(xì)胞類型上，兩者均認(rèn)可人全血、PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞，至少 4 個(gè)供體，歐洲藥典建議 8 個(gè)供體），中國(guó)藥典明確將單核細(xì)胞系納入，歐洲藥典則要求單核細(xì)胞系需做支原體污染檢測(cè)、細(xì)胞鑒別等；檢測(cè)方法均為 “熱原刺激細(xì)胞 + ELISA 檢測(cè) IL-6/IL-1β/TNF-α”。復(fù)孔數(shù)方面，兩者均規(guī)定平行孔≥4、濃度點(diǎn)≥4，中國(guó)藥典額外要求標(biāo)曲 r≥0.90，主要目的是通過(guò)多重復(fù)孔抵消 PBMC 的不穩(wěn)定性，確保熱原檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。