江蘇熱原檢測(cè)技術(shù)服務(wù)

MAT 試劑盒配套的即用型細(xì)胞存在明確的傳代限制，且商業(yè)化傳代需獲得授權(quán)，關(guān)鍵是保障細(xì)胞質(zhì)量與檢測(cè)可靠性。首先，即用型細(xì)胞經(jīng)特殊工藝優(yōu)化，已處于較好的活性與熱原響應(yīng)狀態(tài)，不適合傳代，傳代后細(xì)胞會(huì)出現(xiàn) TLR 受體表達(dá)下降、炎癥因子分泌減少等問題，導(dǎo)致熱原檢測(cè)靈敏度降低，如 HL-60 細(xì)胞傳代超過 5 代后，IL-6 分泌量下降 30%，無法滿足檢測(cè)要求。其次，若用戶需將即用型細(xì)胞用于商業(yè)化生產(chǎn)（如大規(guī)模檢測(cè)），需獲得湖州申科授權(quán)，包括用戶資質(zhì)審核、技術(shù)培訓(xùn)、傳代方案驗(yàn)證，確保用戶具備細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)量控制能力，避免未經(jīng)授權(quán)傳代導(dǎo)致細(xì)胞特性改變，影響檢測(cè)結(jié)果一致性。此外，參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，即使是可傳代的單核細(xì)胞系，使用代次也不超過 20 代，超過后代次細(xì)胞穩(wěn)定性差，因此即用型細(xì)胞設(shè)計(jì)為 “一次性使用”，從源頭避免傳代帶來的風(fēng)險(xiǎn)。用戶需嚴(yán)格遵守傳代限制，若需長(zhǎng)期使用，建議定期采購新批次試劑盒，確保細(xì)胞質(zhì)量。

PyroSHENTEK^®熱原檢測(cè)試劑盒突破傳統(tǒng)檢測(cè)方法局限，不僅能檢測(cè)革蘭氏陰性菌來源的內(nèi)毒素，還可準(zhǔn)確識(shí)別革蘭氏陽性菌（脂磷壁酸 LTA）、病毒、真菌等產(chǎn)生的非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EP），契合熱原檢測(cè) “全風(fēng)險(xiǎn)覆蓋” 的法規(guī)需求。其定量限低至 0.025EU/mL，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，對(duì) Flagellin、LTA、Resiquimod、Poly-IC 等多種 NEP 均能有效檢出，且加標(biāo)回收率穩(wěn)定在 50%-200% 合格范圍（如貝伐珠單抗注射液中 LTA 加標(biāo)回收率 66.8%、Zysoman 加標(biāo)回收率 113%）。此外，試劑盒聯(lián)合了國(guó)內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)完成室間驗(yàn)證，與傳統(tǒng)家兔熱原試驗(yàn)（RPT）橋接結(jié)果高度一致 —— 如人用狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞）中 LPS 加標(biāo)回收率 152.1%、人血白蛋白中 LPS 加標(biāo)回收率 71.6%，檢測(cè)數(shù)據(jù)科學(xué)性符合國(guó)際法規(guī)要求，助力企業(yè)無縫銜接中美歐等地申報(bào)標(biāo)準(zhǔn)。

中國(guó)藥典對(duì) MAT 法熱原檢測(cè)要求 4 復(fù)孔，未明確 CV 限值，需結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)特性合理解讀與操作。藥典不設(shè) CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞活性易受環(huán)境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩(wěn)定性，過嚴(yán)的 CV 要求可能脫離實(shí)際；但實(shí)驗(yàn)室可通過積累多批次數(shù)據(jù)，制定內(nèi)部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測(cè)重復(fù)性。關(guān)于 3 復(fù)孔的適用性：若長(zhǎng)期數(shù)據(jù)顯示 CV 控制良好（如連續(xù) 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過程檢測(cè)（非 QC 放行），可嘗試 3 復(fù)孔，但需同步設(shè)置加標(biāo)對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)果可靠性；若為 QC 放行檢測(cè)，仍建議按 4 復(fù)孔操作，符合藥典下限要求。對(duì)于異常點(diǎn)處理，可采用狄克遜準(zhǔn)則（Q 檢驗(yàn)）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 —— 如某復(fù)孔 IL-6 檢測(cè)值偏離平均值 30% 以上，且無明顯操作誤差（如加樣錯(cuò)誤），可判定為異常點(diǎn)并剔除，但需在原始記錄中詳細(xì)說明原因，確保數(shù)據(jù)可追溯，避免隨意剔除導(dǎo)致結(jié)果失真。

MAT法熱原檢測(cè)中，ELISA 加終止液后的讀數(shù)時(shí)間需嚴(yán)格控制，以保障 IL-6 檢測(cè)信號(hào)穩(wěn)定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求，終止液添加后需在 10 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，且需避光操作 —— 原因在于，終止液（如硫酸）會(huì)終止 TMB 顯色反應(yīng)，但生成的黃色產(chǎn)物在光照下易降解，超過 10 分鐘后 OD 值會(huì)下降，導(dǎo)致 IL-6 檢測(cè)值偏低。讀數(shù)前需進(jìn)行 30 秒震蕩混勻，確保孔內(nèi)液體濃度均勻，避免因局部濃度差異導(dǎo)致復(fù)孔 OD 值波動(dòng)。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)需設(shè)置為 450nm，若儀器含 600nm 參考波長(zhǎng)，可同時(shí)檢測(cè) 600nm 波長(zhǎng)以扣除背景干擾（如細(xì)胞碎片導(dǎo)致的光散射），提升檢測(cè)準(zhǔn)確性。需注意的是，讀數(shù)時(shí)不可覆蓋封板膜或蓋子，避免膜上凝結(jié)的水蒸氣滴入孔中，導(dǎo)致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時(shí)讀數(shù)，需將微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，同時(shí)在記錄中注明延遲原因，評(píng)估延遲對(duì)結(jié)果的影響（如延遲 20 分鐘，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測(cè)革蘭氏陰性菌的 LPS，無法識(shí)別革蘭氏陽性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非內(nèi)毒素?zé)嵩?，存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，部分樣品（如脂質(zhì)體、表面活性劑制劑）會(huì)因內(nèi)毒素吸附導(dǎo)致低內(nèi)毒素回收（LER），BET法難以準(zhǔn)確定量。MAT 法通過單核細(xì)胞表面的多種 TLR 受體（TLR1-TLR10），可識(shí)別不同類型熱原：TLR4 識(shí)別 LPS、TLR2/TLR6 識(shí)別 LTA 與酵母多糖、TLR5 識(shí)別鞭毛蛋白、TLR3 識(shí)別病毒 dsRNA 等，實(shí)現(xiàn) “全熱原覆蓋”。湖州申科生物熱原檢測(cè)試劑盒（MAT法）的驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，其對(duì)不同濃度非內(nèi)毒素?zé)嵩许憫?yīng)：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可檢測(cè)到 0.005-0.035EU/mL熱原活性，0.1-10μg/mL LTA 對(duì)應(yīng) 0.1-0.7EU/mL 熱原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配體）對(duì)應(yīng) 0.5-3.0EU/mL 熱原活性。此外，MAT法檢測(cè)的是熱原的生物活性（而非單純 LPS 含量），可避免 LER 導(dǎo)致的假陰性，為CGT等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品提供更有保障的熱原檢測(cè)方案。

熱原檢測(cè)技術(shù)自 20 世紀(jì)初問世以來，經(jīng)歷了 “動(dòng)物試驗(yàn)→體外生化檢測(cè)→細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)” 的三次關(guān)鍵變革，每一次變革均推動(dòng)檢測(cè)效率、準(zhǔn)確性與全面性的提升。20 世紀(jì)初至中期，熱原檢測(cè)方法只有家兔熱原試驗(yàn)，通過觀察家兔體溫變化篩查熱原，雖實(shí)現(xiàn)了廣譜檢測(cè)，但存在動(dòng)物成本高、操作繁瑣、靈敏度低、種屬差異大等局限，難以滿足制藥行業(yè)快速發(fā)展需求。20 世紀(jì) 60 年代，鱟試驗(yàn)法（LAL 法）的發(fā)明開啟了熱原檢測(cè)的 “體外生化時(shí)代”，利用鱟血變形細(xì)胞裂解物的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，靈敏度提升至 ng 級(jí)，檢測(cè)時(shí)間縮短至 1-2 小時(shí)，迅速成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法；但該方法依賴鱟資源，易受 β- 葡聚糖干擾，且只能檢測(cè)內(nèi)毒素，無法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩?1 世紀(jì)以來，重組技術(shù)與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)熱原檢測(cè)進(jìn)入 “全熱原管控時(shí)代”：重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）與重組 C 因子試劑（rFC）通過基因工程技術(shù)制備，擺脫對(duì)鱟資源的依賴，消除葡聚糖干擾，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定（MAT）利用人源單核細(xì)胞檢測(cè)全類型熱原，填補(bǔ)非內(nèi)毒素?zé)嵩瓩z測(cè)空白，且結(jié)果更貼近人體實(shí)際反應(yīng)。