上海原料藥內(nèi)毒素檢測風(fēng)險評估

來源： 發(fā)布時間：2025-11-24

內(nèi)毒素檢測的實驗方案需遵循“標曲可靠性驗證（靈敏度復(fù)核）-稀釋倍數(shù)計算-干擾試驗”的完整流程，以保障檢測結(jié)果準確合規(guī)。首先進行標曲可靠性試驗，用標準內(nèi)毒素制備至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不超過10，下限濃度不低于鱟試劑標示檢測限），每濃度設(shè) 3 支平行管，同時做2支陰性對照；當(dāng)陰性對照的吸光度小于或透光率大于標準曲線下限的檢測值或反應(yīng)時間大于標準曲線下限的反應(yīng)時間，對數(shù)據(jù)進行線性回歸，相關(guān)系數(shù)r的幅值≥0.980時試驗方有效，否則需重新操作。接著按公式 L=K/M 確定樣本內(nèi)毒素限值，K 值依給藥途徑而定，M結(jié)合人均60kg體重、1.62m2 體表面積及上限給藥劑量計算，也可參考藥典行標。隨后明確有效稀釋上限倍數(shù)（MVD），即供試品允許稀釋的上限倍數(shù)，確保在此范圍內(nèi)檢測限值。再開展樣本干擾試驗，制備供試品溶液（A）、供試品加標溶液（B，加標濃度為標曲中點）、標準曲線溶液（C）及陰性對照（D），按公式 R=(Cs-Ct)/λm×100%計算加標回收率，50%-200%為合格；若鱟試劑、生產(chǎn)工藝等發(fā)生變化，需重新進行干擾試驗，保障內(nèi)毒素檢測的可靠性。
細菌內(nèi)毒素檢查有凝膠法和光度測定法，結(jié)果有爭議時，除規(guī)定外以凝膠限度試驗為準。上海原料藥內(nèi)毒素檢測風(fēng)險評估

上海原料藥內(nèi)毒素檢測風(fēng)險評估,內(nèi)毒素檢測

β- 葡聚糖是鱟試劑（LAL）檢測內(nèi)毒素的常見干擾物，可活化 LAL 中的 G 因子通路，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。干擾多見于含植物源原料的樣品（如中藥注射劑）、生物發(fā)酵產(chǎn)物或環(huán)境真菌污染的樣品。消除方法包括：使用特異性 LAL 試劑（如添加葡聚糖抑制劑的 LAL），其只對內(nèi)毒素敏感而不受 β- 葡聚糖影響；采用加熱處理（如 80℃加熱 10 分鐘）破壞 β- 葡聚糖結(jié)構(gòu)；或通過親和層析去除樣品中的 β- 葡聚糖。檢測時需設(shè)置 β- 葡聚糖陽性對照，若對照反應(yīng)陽性而內(nèi)毒素標準品無反應(yīng)，表明存在干擾，需優(yōu)化前處理步驟后重新檢測。
浙江細菌內(nèi)毒素檢測操作步驟內(nèi)毒素檢測需關(guān)注制劑成分，螯合劑和表面活性劑可能誘發(fā)“低內(nèi)毒素回收（LER）”。

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內(nèi)毒素檢測重組級聯(lián)試劑（rCR）在方法橋接方面具有明顯優(yōu)勢，可大幅度降低實驗室的轉(zhuǎn)換成本。在設(shè)備兼容性上，rCR 無需額外采購新設(shè)備，完全適配天然鱟動態(tài)顯色法現(xiàn)用的酶標儀（如 Molecular Devices、Tecan sunrise、Thermo MultiSkan ET 等品牌），支持 405nm 波長動態(tài)讀數(shù)和 37℃恒溫孵育。操作流程上，rCR 的樣品處理、試劑混合、加樣孵育等步驟與天然鱟試劑一致，實驗室無需重新培訓(xùn)操作人員或修改 SOP。顯色系統(tǒng)方面，rCR 沿用與天然試劑相同的 PNA 顯色底物，通過黃色信號變化定量，檢測原理和數(shù)據(jù)分析方法保持不變。這種高度兼容性使實驗室能快速完成方法驗證和切換，加速重組試劑的合規(guī)應(yīng)用進程。

檢測細菌內(nèi)毒素的堂試劑方法，是一個生物反應(yīng)過程，受到很多因素的干擾。在一個供試品的檢測方法固定下來之前，為了得到準確的結(jié)果，必須要了解供試品與鱟試劑之間的相互關(guān)系。供試品中的成分往往非常復(fù)雜，而且會干擾試驗檢測系統(tǒng)的功能。很多干擾的機理，并不是非常清楚。但是業(yè)界比較能夠接受的理論是，如果供試品中某些因子影響了鱟試劑中蛋白的表達功能，則被認為是干擾作用（Inhibition/Enhancement，V/E）。干擾作用產(chǎn)生的因素較多，一般包括試劑因素（鱟試劑、內(nèi)毒素標準品）供試品因素（pH值、溫度、離子強度、濃度、水溶性、黏度、可發(fā)生鱟試劑反應(yīng)的非內(nèi)毒素雜質(zhì)）和實驗因素（試驗器皿、細菌內(nèi)毒素檢查用水、鱟試劑抗干擾能力）等。
內(nèi)毒素檢測方法學(xué)驗證需覆蓋線性、精密度，確保不同批次檢測結(jié)果穩(wěn)定。

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細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜釋放的脂多糖（LPS）成分，具有極強的生物活性，微量即可引發(fā)人體發(fā)熱、休克甚至多臟器功能衰竭。因此，在生物制品、醫(yī)療器械、制藥用水等領(lǐng)域，細菌內(nèi)毒素檢測是保障產(chǎn)品安全性的關(guān)鍵質(zhì)控環(huán)節(jié)。其檢測原理基于內(nèi)毒素與特定試劑的特異性反應(yīng)：內(nèi)毒素可活化鱟血變形細胞裂解物（LAL）中的凝血級聯(lián)反應(yīng)，通過C因子通路觸發(fā)酶促反應(yīng)，通過觀察凝膠形成、濁度變化或顯色強度實現(xiàn)定量或定性分析。目前，各國藥典均將內(nèi)毒素檢測列為強制要求，以降低臨床應(yīng)用中的熱原風(fēng)險。
鱟試劑含多種酶和輔助因子，批次間活性差異可能導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測結(jié)果變異性。浙江細菌內(nèi)毒素檢測操作步驟

內(nèi)毒素工作標準品（CSE）稀釋液配制時渦旋很重要，可使內(nèi)毒素充分溶解，保證濃度準確。上海原料藥內(nèi)毒素檢測風(fēng)險評估

重組試劑（rCR、rFC）是解決 LER 的重要工具，優(yōu)化內(nèi)毒素檢測性能。重組鱟試劑（rCR）通過基因工程表達 C、B 因子及凝固酶原，剔除 G 因子，完全模擬天然鱟級聯(lián)反應(yīng)，靈敏度達 0.005EU/mL，與天然方法橋接容易，能避免 LPS 結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的假陰性；重組 C 因子（rFC）靈敏度 0.005-5EU/mL，性狀穩(wěn)定、均一性好，雖需熒光酶標儀，但對部分 LER 場景（如無蛋白質(zhì)干擾）適配性強。二者擺脫了天然鱟試劑的局限，為內(nèi)毒素檢測提供更抗 LER 的選擇，契合行業(yè)技術(shù)趨勢。
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