北京醫(yī)療器械內(nèi)毒素檢測(cè)合規(guī)申報(bào)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)充分證明，內(nèi)毒素檢測(cè)重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）與天然鱟試劑的檢測(cè)結(jié)果具有高度等效性，可實(shí)現(xiàn)方法無(wú)縫切換。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)輔料、凍干甲型肝炎疫苗、單抗 A/B 等 8 類代表性樣品的平行檢測(cè)顯示，rCR 的檢測(cè)平均值為 0.001-0.026EU/mL，天然鱟試劑為 0.002-0.034EU/mL，兩者偏差≤0.003EU/mL。加標(biāo)回收率方面，rCR 為 70%-175.4%，天然鱟試劑為 82.2%-156.6%，均處于 50%-200% 的合格范圍。批內(nèi)精密度上，rCR 的 CV 值為 0.524%-14.716%，天然鱟試劑為 0.908%-12.348%，均滿足法規(guī)對(duì)精密度的要求。這種等效性確保了實(shí)驗(yàn)室在切換至重組試劑時(shí)，歷史數(shù)據(jù)和工藝控制標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)性，降低方法轉(zhuǎn)換風(fēng)險(xiǎn)。

樣品中的脂質(zhì)體與表面活性劑，會(huì)通過(guò)不同機(jī)制干擾內(nèi)毒素檢測(cè)，需結(jié)合基質(zhì)特性選擇處理方式。脂質(zhì)體的干擾體現(xiàn)在兩方面：一是脂質(zhì)雙分子層會(huì)包裹內(nèi)毒素，使其無(wú)法與鱟試劑接觸，導(dǎo)致假陰性；二是脂質(zhì)體的膠體性質(zhì)會(huì)干擾凝膠形成（凝膠法）或光度信號(hào)讀?。岫?/ 顯色法）。針對(duì)完整脂質(zhì)體制劑，可先用生理鹽水稀釋降低脂質(zhì)體濃度，減少包裹作用；若需徹底釋放內(nèi)毒素，還可使用 DMSO、乙醇或甲醇等溶劑裂解脂質(zhì)體，暴露被包裹的內(nèi)毒素。表面活性劑的干擾則源于其對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變：既可能破壞內(nèi)毒素的聚集體結(jié)構(gòu)，影響其活性；又可能導(dǎo)致鱟試劑中蛋白質(zhì)變性，抑制反應(yīng)。對(duì)此，可通過(guò)內(nèi)毒素檢查用水或生理鹽水稀釋樣品，降低表面活性劑濃度，消除其對(duì)結(jié)構(gòu)的破壞作用。這些針對(duì)性處理能有效解決脂質(zhì)體與表面活性劑的干擾，確保內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。

內(nèi)毒素檢測(cè)中，樣品中的蛋白質(zhì)或酶的修飾作用易破壞鱟試劑的反應(yīng)體系，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果失真。鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素的本質(zhì)是一系列絲氨酸蛋白酶的酶促放大過(guò)程，若樣品中存在氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑或?qū)Ｒ皇Щ顒?，?huì)直接滅活反應(yīng)所需的酶；而乙醇、苯酚等物質(zhì)則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，同樣抑制反應(yīng)進(jìn)程。例如，某些生物制品中含有的蛋白水解酶，可能提前降解鱟試劑中的蛋白酶，使內(nèi)毒素?zé)o法被正常檢測(cè)。為消除這類干擾，需優(yōu)先限制樣品中抑制物的含量：可采用內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品，降低抑制物濃度；對(duì)耐熱的抑制物（如部分蛋白水解酶），可通過(guò)加熱滅活處理（如 56℃孵育 30 分鐘）破壞其活性；若樣品基質(zhì)復(fù)雜，還可使用超濾技術(shù)分離內(nèi)毒素與干擾蛋白質(zhì)，避免修飾作用對(duì)酶促反應(yīng)的影響，保障內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

β- 葡聚糖是鱟試劑（LAL）檢測(cè)內(nèi)毒素的常見干擾物，可活化 LAL 中的 G 因子通路，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。干擾多見于含植物源原料的樣品（如中藥注射劑）、生物發(fā)酵產(chǎn)物或環(huán)境真菌污染的樣品。消除方法包括：使用特異性 LAL 試劑（如添加葡聚糖抑制劑的 LAL），其只對(duì)內(nèi)毒素敏感而不受 β- 葡聚糖影響；采用加熱處理（如 80℃加熱 10 分鐘）破壞 β- 葡聚糖結(jié)構(gòu)；或通過(guò)親和層析去除樣品中的 β- 葡聚糖。檢測(cè)時(shí)需設(shè)置 β- 葡聚糖陽(yáng)性對(duì)照，若對(duì)照反應(yīng)陽(yáng)性而內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)反應(yīng)，表明存在干擾，需優(yōu)化前處理步驟后重新檢測(cè)。

低內(nèi)毒素回收（LER）的主要形成機(jī)制之一是螯合劑與非離子表面活性劑的協(xié)同作用，直接影響內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果。第一步，樣品中的螯合劑（如檸檬酸鹽）會(huì)去除二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2?、Ca2?），削弱 LPS 聚集體的鹽橋結(jié)構(gòu)，降低其剛性；第二步，表面活性劑（如吐溫 20）嵌入 LPS 分子，形成混合聚集體（膠體、層狀結(jié)構(gòu)），改變 LPS 的超分子形態(tài)。LPS 從 “可檢測(cè)態(tài)” 轉(zhuǎn)為 “不可檢測(cè)態(tài)”，導(dǎo)致鱟試劑中的 C 因子無(wú)法與內(nèi)毒素結(jié)合，內(nèi)毒素檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。這種變化是時(shí)間依賴的，與稀釋度無(wú)關(guān)，給常規(guī)內(nèi)毒素檢測(cè)帶來(lái)獨(dú)特挑戰(zhàn)。

在開展內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，樣品的 pH 值與二價(jià)離子（Mg2?、Ca2?）水平是影響鱟試劑酶促反應(yīng)的關(guān)鍵因素，直接關(guān)系檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素依賴絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，該反應(yīng)的合適 pH 值范圍為 6.0-8.0，若樣品過(guò)酸或過(guò)堿，會(huì)快速降低酶活性，甚至導(dǎo)致酶徹底失活，進(jìn)而出現(xiàn)內(nèi)毒素檢測(cè)假陰性。針對(duì)這一問(wèn)題，可使用 0.1N 或更低濃度的 HCl/NaOH 溶液，將樣品 pH 值準(zhǔn)確調(diào)節(jié)至適宜區(qū)間，為反應(yīng)提供穩(wěn)定環(huán)境。同時(shí)，二價(jià)離子是反應(yīng)必需的輔助因子：Mg2?是內(nèi)毒素活化鱟試劑的關(guān)鍵，缺乏會(huì)直接阻斷反應(yīng)啟動(dòng)；Ca2?雖參與酶促反應(yīng)，但濃度過(guò)高會(huì)反向抑制反應(yīng)效率。若樣品中含有肝素鈉、EDTA、檸檬酸鈉等螯合劑，會(huì)與二價(jià)離子結(jié)合導(dǎo)致其濃度不足，此時(shí)可通過(guò)內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品降低螯合劑濃度，或添加特定二價(jià)離子試劑補(bǔ)充，但需嚴(yán)格控制離子濃度，避免過(guò)度增強(qiáng)反應(yīng)引發(fā)誤差，確保內(nèi)毒素檢測(cè)能真實(shí)反映樣品中的內(nèi)毒素殘留量。