廣東內(nèi)毒素檢測抗干擾方案

來源： 發(fā)布時(shí)間：2025-11-27

在內(nèi)毒素檢測的技術(shù)體系中，凝膠法與動態(tài)顯色法基于不同原理與特性，形成互補(bǔ)應(yīng)用格局。凝膠法依托鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)定性或半定量檢測，其靈敏度覆蓋 0.03EU/ml、0.06EU/ml 等多梯度，60 分鐘即可完成反應(yīng)；檢測結(jié)果依賴肉眼觀察（180° 倒轉(zhuǎn)判讀凝膠形成），數(shù)據(jù)需手工記錄，配套 內(nèi)毒素凝膠法測定儀（恒溫儀） 即可開展，雖自動化程度有限，但操作簡潔，適用于生產(chǎn)環(huán)節(jié)的快速初篩。與之相比，動態(tài)顯色法通過監(jiān)測反應(yīng)混合物吸光度或透光率的變化（如達(dá)預(yù)設(shè)檢測值的反應(yīng)時(shí)間、信號增速）實(shí)現(xiàn) 定量檢測 ，靈敏度拓展至 5-0.005EU/ml ，60-90 分鐘反應(yīng)時(shí)長雖略長，卻可借助酶標(biāo)儀或全自動內(nèi)毒素檢測分析儀完成全流程自動化操作—軟件實(shí)時(shí)采集數(shù)據(jù)，契合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）對數(shù)據(jù)追溯與精度的要求。二者各有側(cè)重：凝膠法以 “快速定性” 服務(wù)基礎(chǔ)防控，動態(tài)顯色法憑 “準(zhǔn)確定量 + 自動化” 支撐嚴(yán)苛質(zhì)控，共同為內(nèi)毒素檢測提供靈活適配的技術(shù)路徑。
重組級聯(lián)試劑（rCR）抗干擾能力強(qiáng)于重組 C 因子（rFC），適配高蛋白、疫苗等復(fù)雜樣本檢測。廣東內(nèi)毒素檢測抗干擾方案

廣東內(nèi)毒素檢測抗干擾方案,內(nèi)毒素檢測

內(nèi)毒素檢測常與熱原檢測混淆，二者既有關(guān)聯(lián)又有區(qū)別：熱原是指所有能引起發(fā)熱的物質(zhì)（包括內(nèi)毒素、病毒、真菌等），通過傳統(tǒng)家兔熱原試驗(yàn)檢測；內(nèi)毒素是熱原的主要成分（占 90% 以上），檢測更具特異性。目前，家兔熱原試驗(yàn)因操作復(fù)雜、動物成本高，已逐漸被單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法（MAT）替代，但部分產(chǎn)品（如放射性質(zhì)藥物、血液制品）仍需保留家兔試驗(yàn)作為補(bǔ)充。法規(guī)要求內(nèi)毒素檢測結(jié)果需與熱原風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)，若內(nèi)毒素檢測合格但臨床出現(xiàn)熱原反應(yīng)，需排查是否存在非內(nèi)毒素類熱原，通過聯(lián)合檢測確保產(chǎn)品安全性。
北京疫苗內(nèi)毒素檢測合規(guī)申報(bào)表面活性劑會改變內(nèi)毒素活性，用重組級聯(lián)試劑檢測前需稀釋樣本，消除其對反應(yīng)的干擾。

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隨著動物保護(hù)理念和法規(guī)要求升級，重組因子C法（rFC法）作為 LAL 法的替代技術(shù)逐漸普及。重組 C 因子是以基因重組的方式表達(dá)的 LAL 試劑中的 C 因子，C 因子被內(nèi)毒素活化后切割熒光底物產(chǎn)生游離熒光基團(tuán)，通過檢測熒光信號可以反應(yīng)活化后的蛋白酶活性，并由此可以推算出內(nèi)毒素的含量。與傳統(tǒng) LAL 法相比，rFC 法無需依賴鱟血資源，避免了天然 LAL 試劑批間差異大、易受 β- 葡聚糖干擾等問題，且反應(yīng)特異性更強(qiáng)。目前，《美國藥典》、《歐洲藥典》等法規(guī)已收錄 rFC 法，歐盟更推薦其用于疫苗等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品檢測，在保證檢測準(zhǔn)確性的同時(shí)，符合動物福利和可持續(xù)發(fā)展要求。

內(nèi)毒素檢測方法驗(yàn)證需覆蓋多項(xiàng)參數(shù)，確保方法可靠：線性范圍需包含樣品預(yù)期濃度（如 0.01-10 EU/mL），相關(guān)系數(shù) R2≥0.98；準(zhǔn)確度通過加標(biāo)回收率評估，應(yīng)在 50%-200% 范圍內(nèi)；精密度包括批內(nèi)和批間精密度，CV 值均應(yīng)≤15%；檢測限（LOD）需低于產(chǎn)品限值的 1/2（如限值 0.5 EU/mL，LOD 應(yīng)≤0.25 EU/mL）；專屬性需證明無干擾物質(zhì)影響（如 β- 葡聚糖、蛋白質(zhì)不引發(fā)假陽性）。驗(yàn)證通過后，方法需經(jīng)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)方可使用，且定期需進(jìn)行一次回顧性驗(yàn)證，確認(rèn)方法持續(xù)有效。
內(nèi)毒素檢查用水經(jīng)二次精制，無菌無熱原，避免檢測假陽假陰。

廣東內(nèi)毒素檢測抗干擾方案,內(nèi)毒素檢測

內(nèi)毒素檢測中，樣品中的蛋白質(zhì)或酶的修飾作用易破壞鱟試劑的反應(yīng)體系，導(dǎo)致檢測結(jié)果失真。鱟試劑檢測內(nèi)毒素的本質(zhì)是一系列絲氨酸蛋白酶的酶促放大過程，若樣品中存在氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑或?qū)Ｒ皇Щ顒瑫苯訙缁罘磻?yīng)所需的酶；而乙醇、苯酚等物質(zhì)則會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，同樣抑制反應(yīng)進(jìn)程。例如，某些生物制品中含有的蛋白水解酶，可能提前降解鱟試劑中的蛋白酶，使內(nèi)毒素?zé)o法被正常檢測。為消除這類干擾，需優(yōu)先限制樣品中抑制物的含量：可采用內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品，降低抑制物濃度；對耐熱的抑制物（如部分蛋白水解酶），可通過加熱滅活處理（如 56℃孵育 30 分鐘）破壞其活性；若樣品基質(zhì)復(fù)雜，還可使用超濾技術(shù)分離內(nèi)毒素與干擾蛋白質(zhì)，避免修飾作用對酶促反應(yīng)的影響，保障內(nèi)毒素檢測結(jié)果的可靠性。
內(nèi)毒素檢測復(fù)孔 CV＞15%，需校準(zhǔn)移液槍，規(guī)范加樣，排查耗材污染。廣東生物制品內(nèi)毒素檢測重組級聯(lián)試劑（rCR）

湖州申科內(nèi)毒素檢測服務(wù)含低內(nèi)毒素回收，通過不同樣品前處理方式搭配多種檢測方法，較大程度解決LER問題。廣東內(nèi)毒素檢測抗干擾方案

低內(nèi)毒素回收（LER）又稱內(nèi)毒素掩蔽，是指無菌制劑（尤其蛋白類生物制劑）進(jìn)行內(nèi)毒素檢測時(shí)，加標(biāo)內(nèi)毒素的回收率＜50% 的現(xiàn)象，且無法通過稀釋排除，區(qū)別于傳統(tǒng)檢測干擾。LER 會導(dǎo)致內(nèi)毒素污染被低估，已被全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)重點(diǎn)關(guān)注：FDA 2013 年要求生物藥 BLA 申報(bào)時(shí)提交 LER 研究報(bào)告；EMA 2023 年明確含表面活性劑（如吐溫）或螯合劑（如 EDTA）的制劑需提供 LER 數(shù)據(jù)；中國藥典 2025 版 9251 通則也新增 LER 內(nèi)容，與國際接軌。這些要求促使企業(yè)優(yōu)化內(nèi)毒素檢測流程，避免因 LER 導(dǎo)致的檢測偏差，確保藥品安全。
廣東內(nèi)毒素檢測抗干擾方案