廣東熱原檢測(cè)

中國(guó)藥典對(duì) MAT 法熱原檢測(cè)要求 4 復(fù)孔，未明確 CV 限值，需結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)特性合理解讀與操作。藥典不設(shè) CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞活性易受環(huán)境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩(wěn)定性，過(guò)嚴(yán)的 CV 要求可能脫離實(shí)際；但實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)積累多批次數(shù)據(jù)，制定內(nèi)部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測(cè)重復(fù)性。關(guān)于 3 復(fù)孔的適用性：若長(zhǎng)期數(shù)據(jù)顯示 CV 控制良好（如連續(xù) 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過(guò)程檢測(cè)（非 QC 放行），可嘗試 3 復(fù)孔，但需同步設(shè)置加標(biāo)對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)果可靠性；若為 QC 放行檢測(cè)，仍建議按 4 復(fù)孔操作，符合藥典下限要求。對(duì)于異常點(diǎn)處理，可采用狄克遜準(zhǔn)則（Q 檢驗(yàn)）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 —— 如某復(fù)孔 IL-6 檢測(cè)值偏離平均值 30% 以上，且無(wú)明顯操作誤差（如加樣錯(cuò)誤），可判定為異常點(diǎn)并剔除，但需在原始記錄中詳細(xì)說(shuō)明原因，確保數(shù)據(jù)可追溯，避免隨意剔除導(dǎo)致結(jié)果失真。

湖州申科生物熱原檢測(cè)（MAT法） 試劑盒在靈敏度、穩(wěn)定性與適用性上表現(xiàn)突出，關(guān)鍵性能參數(shù)符合藥典要求：標(biāo)曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，相關(guān)系數(shù) R2≥0.98，定量限 0.025EU/mL，檢測(cè)限（LOD）0.0125EU/mL，批間精密度 CV≤25%，可準(zhǔn)確捕捉微量熱原。其優(yōu)勢(shì)在于特定的單核細(xì)胞系 —— 與依賴供體血液的 PBMC 細(xì)胞不同，申科 MAT 細(xì)胞系來(lái)源清晰可溯源，無(wú)需倫理審批與血站合作，規(guī)避供體差異導(dǎo)致的檢測(cè)波動(dòng)。對(duì)比同類型產(chǎn)品（如國(guó)外廠家 PBMC 細(xì)胞），申科細(xì)胞系的標(biāo)曲各濃度點(diǎn) CV 更低（ 低至3.6%）、相對(duì)偏差更小（ 12.31%），線性 R2 達(dá) 1.000，穩(wěn)定性更優(yōu)。此外，細(xì)胞凍存液組分經(jīng)優(yōu)化，復(fù)蘇后活率高，無(wú)需額外調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)即可直接與供試品共孵育，操作便捷；且適配任何具備 450nm 波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀，無(wú)需專門的設(shè)備，降低實(shí)驗(yàn)室投入成本。

含消除炎癥成分的樣品可能抑制 IL-6 產(chǎn)生，需通過(guò)科學(xué)評(píng)估排除干擾，確保 MAT 法熱原檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。根據(jù)藥典要求，若樣品能抑制單核細(xì)胞促炎癥因子釋放，需通過(guò)以下步驟驗(yàn)證適用性：首先，選擇樣品 A、2A、4A 倍稀釋（均不超過(guò)上限有效稀釋倍數(shù) MVD），避免高濃度消除炎癥成分過(guò)度抑制；其次，進(jìn)行供試品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，若回收率在 50%-200% 的合格范圍，說(shuō)明消除炎癥成分未影響熱原檢測(cè)；再對(duì)比 “供試品配制的標(biāo)曲” 與 “稀釋液配制的標(biāo)曲”，若兩者 IL-6 檢測(cè)值相差在 ±20% 以內(nèi)，表明樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)無(wú)系統(tǒng)性干擾。例如，某消除炎癥單抗樣品經(jīng) 2 倍稀釋后，加標(biāo)回收率達(dá) 120%，兩種標(biāo)曲 IL-6 值相差 15%，判定可適用 MAT 法。若出現(xiàn)回收率偏低（<50%），可嘗試增加稀釋倍數(shù)（如 8A 倍）或采用熱滅活（若樣品耐熱）去除消除炎癥活性；若仍無(wú)法排除干擾，需結(jié)合家兔法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，避免因消除炎癥成分導(dǎo)致假陰性。

家兔熱原試驗(yàn)作為熱原檢測(cè)領(lǐng)域的 “法定傳統(tǒng)方法”，被中國(guó)藥典（ChP）、美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測(cè)項(xiàng)目，其主要優(yōu)勢(shì)在于可通過(guò)家兔體溫應(yīng)答篩查所有類型熱原，尤其適用于無(wú)法排除非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜母唢L(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，如血液制品、放射性質(zhì)藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗(yàn)存在明顯局限：動(dòng)物個(gè)體差異大，需額外投入時(shí)間與成本篩選合格家兔；檢測(cè)周期長(zhǎng)（至少 6 小時(shí)），無(wú)法滿足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對(duì) LPS 檢測(cè)限≥5EU/kg），與全球倡導(dǎo)的“動(dòng)物福利3R原則”背道而馳。

MAT法熱原檢測(cè)特定標(biāo)準(zhǔn)品與傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品存在本質(zhì)差異，需明確區(qū)分以保障檢測(cè)準(zhǔn)確性。MAT 特定標(biāo)準(zhǔn)品為大腸桿菌（E.coli 0113:H10:K）菌株制備，經(jīng)全國(guó) 5 家藥品檢驗(yàn)所（含中檢院）用凝膠法、動(dòng)態(tài)濁度法及動(dòng)態(tài)顯色法協(xié)作標(biāo)定，溯源至國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，可同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?；而傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（如 9000EU 規(guī)格）源自大腸桿菌（E.coli O111:B4），只適用于內(nèi)毒素檢測(cè)，無(wú)法識(shí)別非內(nèi)毒素?zé)嵩?。關(guān)鍵驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，用 MAT法檢測(cè) 9000EU 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，加標(biāo)回收率不在 50%-200% 的合格范圍，因此不能替代 MAT 特定標(biāo)準(zhǔn)品。值得注意的是，盡管 MAT 試劑盒用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)曲，但經(jīng)驗(yàn)證其可識(shí)別非內(nèi)毒素?zé)嵩魳悠分写嬖诜莾?nèi)毒素?zé)嵩ㄈ绺锾m氏陽(yáng)性菌的脂磷壁酸），會(huì)觸發(fā)細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)，有效避免漏檢，這也是 MAT 法在熱原防控中優(yōu)于單一內(nèi)毒素檢測(cè)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。

在單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）的熱原檢測(cè)中，IL-6 被確定為關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在穩(wěn)定性、生物學(xué)關(guān)聯(lián)性及商業(yè)化應(yīng)用上的優(yōu)勢(shì)。從穩(wěn)定性來(lái)看，IL-6 在體外培養(yǎng)環(huán)境中受個(gè)體免疫狀態(tài)影響較小，半衰期更長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更優(yōu)，且檢測(cè)靈敏度高，能準(zhǔn)確定量熱原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 產(chǎn)生時(shí)間短、表達(dá)量低，還易被蛋白酶降解，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。從生物學(xué)特性而言，IL-6 是先天免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可通過(guò)活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驅(qū)動(dòng)急性期反應(yīng)，如誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生前列腺素 E2（PGE2）觸發(fā)發(fā)熱，與熱原的致熱機(jī)制直接關(guān)聯(lián)，是公認(rèn)的發(fā)熱標(biāo)志物。同時(shí)，MAT 法熱原檢測(cè)會(huì)輔以 IL-1β 和 TNF-α 監(jiān)測(cè) ——IL-1β 反映單核細(xì)胞活化程度，TNF-α 提示炎癥放大效應(yīng)，形成多因子協(xié)同體系。此外，IL-6 的 ELISA 試劑盒市場(chǎng)成熟度高、跨平臺(tái)兼容性強(qiáng)，而 IL-1β 和 TNF-α 的檢測(cè)方法在靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化上仍有局限，進(jìn)一步奠定了 IL-6 的重要地位。