熱原檢測法規(guī)要求

來源： 發(fā)布時間：2025-12-01

革蘭氏陽性菌注射劑產品只依賴內毒素檢測存在安全風險，需結合熱原檢測特性制定防控方案。內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖成分，而革蘭氏陽性菌可產生非內毒素熱原（NEPs），如脂磷壁酸，這類物質同樣能引發(fā)人體發(fā)熱反應，若只檢測內毒素，可能遺漏 NEPs 污染，導致臨床用藥風險。對此，風險評估需重點關注三點：一是建議開展家兔法與內毒素檢測的一致性實驗，對比兩種方法的檢測結果，排查是否存在內毒素未檢出但家兔法陽性的情況；二是采用 MAT 法熱原檢測，其通過單核細胞活化機制，可同時識別內毒素與 NEPs，若 MAT 法檢測陽性，需進一步追溯 NEPs 來源；三是若無法排除 NEPs 風險，必須按藥典要求補充熱原檢測（如 MAT 法或家兔法），而非只依賴內毒素檢測。尤其對于新藥或工藝變更后的產品，需通過多方法驗證，確保熱原檢測覆蓋所有潛在致熱物質，保障臨床用藥安全。
單核細胞活化試驗（MAT）將熱原檢測從經驗性觀察，推進至受體-配體相互作用的分子本質。熱原檢測法規(guī)要求

熱原檢測法規(guī)要求,熱原檢測

中國藥典對 MAT 法熱原檢測要求 4 復孔，未明確 CV 限值，需結合細胞實驗特性合理解讀與操作。藥典不設 CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細胞反應，細胞活性易受環(huán)境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩(wěn)定性，過嚴的 CV 要求可能脫離實際；但實驗室可通過積累多批次數(shù)據(jù)，制定內部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測重復性。關于 3 復孔的適用性：若長期數(shù)據(jù)顯示 CV 控制良好（如連續(xù) 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過程檢測（非 QC 放行），可嘗試 3 復孔，但需同步設置加標對照，驗證結果可靠性；若為 QC 放行檢測，仍建議按 4 復孔操作，符合藥典下限要求。對于異常點處理，可采用狄克遜準則（Q 檢驗）等統(tǒng)計學方法 —— 如某復孔 IL-6 檢測值偏離平均值 30% 以上，且無明顯操作誤差（如加樣錯誤），可判定為異常點并剔除，但需在原始記錄中詳細說明原因，確保數(shù)據(jù)可追溯，避免隨意剔除導致結果失真。
熱原檢測法規(guī)要求在藥品安全語境中，熱原特指細菌性熱原—微生物代謝產物、細菌尸體及內毒素的統(tǒng)稱。

熱原檢測法規(guī)要求,熱原檢測

含消除炎癥成分的樣品可能抑制 IL-6 產生，需通過科學評估排除干擾，確保 MAT 法熱原檢測結果準確。根據(jù)藥典要求，若樣品能抑制單核細胞促炎癥因子釋放，需通過以下步驟驗證適用性：首先，選擇樣品 A、2A、4A 倍稀釋（均不超過上限有效稀釋倍數(shù) MVD），避免高濃度消除炎癥成分過度抑制；其次，進行供試品加標回收率實驗，若回收率在 50%-200% 的合格范圍，說明消除炎癥成分未影響熱原檢測；再對比 “供試品配制的標曲” 與 “稀釋液配制的標曲”，若兩者 IL-6 檢測值相差在 ±20% 以內，表明樣品基質對檢測無系統(tǒng)性干擾。例如，某消除炎癥單抗樣品經 2 倍稀釋后，加標回收率達 120%，兩種標曲 IL-6 值相差 15%，判定可適用 MAT 法。若出現(xiàn)回收率偏低（<50%），可嘗試增加稀釋倍數(shù)（如 8A 倍）或采用熱滅活（若樣品耐熱）去除消除炎癥活性；若仍無法排除干擾，需結合家兔法進行對比驗證，避免因消除炎癥成分導致假陰性。

MAT法熱原檢測中，非內毒素熱原（NEP）對照品設為 “選做”，且試劑盒不默認配備，需結合檢測需求靈活使用，背后有明確的設置邏輯。首先，試劑盒開發(fā)階段已通過驗證（用多種 NEP 配體刺激細胞），證明其可檢出 NEP，后期實驗是否加入 NEP 對照，只需根據(jù)內部管理要求或專業(yè)人員建議確定，無需強制設置；若產品產線明確無 NEP 污染風險（如只使用革蘭氏陰性菌原料），可刪除 NEP 對照，簡化操作。其次，試劑盒不配備 NEP 對照品，是因不同用戶需求差異大 —— 部分用戶需檢測特定 NEP（如脂磷壁酸），部分需檢測廣譜 NEP，因此提供單獨購買選項，用戶可按需選擇，避免資源浪費。NEP 對照品的主要使用場景包括：一是方法驗證階段，用于確認試劑盒對 NEP 的響應性；二是產品工藝變更后，排查是否引入 NEP 污染；三是歐盟申報時，需證明方法可覆蓋 NEP，此時需加入 NEP 對照品并顯示陽性結果。若樣品檢測中 NEP 對照品陽性，而樣品檢測陰性，可排除 NEP 污染；若樣品陽性，則需進一步鑒定熱原類型。
湖州申科熱原檢測試劑盒中單核細胞系表面有多種Toll樣受體，可響應革蘭氏陽性菌、病毒等熱原。

熱原檢測法規(guī)要求,熱原檢測

熱原檢測MAT法的法規(guī)地位持續(xù)提升，已成為多國藥典認可的熱原檢測替代方法。歐洲藥典（EP）是推動 MAT 應用的關鍵力量：通則 2.6.30 明確 MAT 可替代家兔熱原試驗（RPT），且能同時檢測內毒素與非內毒素熱原；2024 年歐洲藥典委員會批準刪除所有條款中的家兔法，修訂文本將于 2025 年7月1日生效，強制鼓勵使用 MAT 等體外替代方法。美國藥典（USP）<151> 規(guī)定，經驗證的體外熱原試驗（如 MAT）可替代家兔法，且需依據(jù) USP<1225>開展驗證；FDA 行業(yè)指南進一步明確 MAT 的合規(guī)性。中國藥典 2020 年版通則 9301 將 MAT 列為熱原檢查的補充方法，雖暫未替代家兔法，但明確其適用于復雜基質樣品的全熱原篩查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等國際標準也優(yōu)先推薦體外熱原檢測模型，全球法規(guī)協(xié)同推動 MAT 成為熱原檢測的主流技術。
MAT 法干擾試驗需設 3 個樣品濃度梯度（A、2A、4A 倍），均不超過MVD且加標回收合格。北京高效熱原檢測MAT法

熱原檢測實驗中，標準化培養(yǎng)基與恒定環(huán)境讓單核細胞系活性穩(wěn)定，避免PBMC凍存后的功能衰減。熱原檢測法規(guī)要求

MAT 法與傳統(tǒng)家兔法在熱原檢測中，性能差異明顯，MAT 法在準確性、效率與合規(guī)性上更具優(yōu)勢。從結果評判來看，MAT 法以 “加標回收率 50%-200%、供試品濃度 < 規(guī)定限值（CLC）” 為合格標準，靈敏度達 0.0125EU/mL，可準確定量熱原濃度；而家兔法只能定性（觀察體溫升高），靈敏度低（約 0.1-0.5EU/mL），易因家兔個體差異（如免疫狀態(tài)、應激反應）導致假陰性。從檢測效率來看，MAT 法樣品與細胞共培養(yǎng) 24 小時即可出結果，且可批量檢測（96 孔板一次處理多個樣品）；家兔法需連續(xù)觀察 72 小時，每次只能檢測少量樣品，耗時且人力成本高。從合規(guī)性來看，MAT 法不使用動物，符合 3R 原則，已被歐盟接受（EP 刪除家兔法）；家兔法因動物實驗屬性，面臨歐盟等地區(qū)的法規(guī)限制。此外，MAT 法重復性優(yōu)（復孔 CV 可控制在 30% 以內），家兔法因個體差異 CV 常超 50%，進一步凸顯 MAT 法在現(xiàn)代熱原檢測中的優(yōu)勢。
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