畢赤酵母宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)抗體覆蓋率驗(yàn)證

宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）是生物制品生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的重要工藝相關(guān)雜質(zhì)，不僅可能引發(fā)患者不良免疫反應(yīng)、超敏反應(yīng)，還可能造成產(chǎn)品蛋白降解等問(wèn)題，進(jìn)而影響生物制品的安全性與有效性，因此成為生物制品質(zhì)量控制中的關(guān)鍵指標(biāo)。目前 HCPs 殘留檢測(cè)的常用方法為 ELISA 法，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高且檢測(cè)通量較高，是 HCPs 殘留的日常放行檢測(cè)方法，各國(guó)藥典均對(duì)采用酶聯(lián)免疫法開(kāi)展 HCPs 殘留檢測(cè)作出規(guī)定。不過(guò)，采用 ELISA 法檢測(cè) HCPs 殘留仍存在不少挑戰(zhàn)：在實(shí)際生產(chǎn)工藝中，宿主細(xì)胞來(lái)源、生產(chǎn)工藝路線、純化技術(shù)、生產(chǎn)規(guī)模等因素，均可能改變 HCPs 的種類與復(fù)雜程度，給檢測(cè)帶來(lái)不確定性。

方法選擇是影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)結(jié)果的因素之一。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）與液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS），是當(dāng)前 HCP 檢測(cè)領(lǐng)域的兩類常用方法。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前在總 HCP 定量檢測(cè)中，ELISA 仍為主流技術(shù)；而 MS 法可用于特定蛋白（如高風(fēng)險(xiǎn)蛋白）的鑒定與定量，已成為重要的互補(bǔ)手段。此外，檢測(cè)過(guò)程中所用試劑與耗材的質(zhì)量，會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。質(zhì)量不達(dá)標(biāo)的試劑，可能引發(fā)檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。舉例來(lái)說(shuō)，若抗體的特異性與親和力不足，可能在 ELISA 檢測(cè)中產(chǎn)生交叉反應(yīng)；若抗原代表性不足或抗體覆蓋率偏低，則可能造成漏檢；而稀釋液抗干擾能力較弱時(shí)，也會(huì)對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。相關(guān)案例研究顯示，采用定制化方法替代原有商業(yè)化試劑盒后，抗原代表性與抗體覆蓋率明顯提升，HCP 檢測(cè)值也呈現(xiàn)整體升高的趨勢(shì)。

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)中，抗體覆蓋率評(píng)估實(shí)驗(yàn)的操作難度較高，需在實(shí)驗(yàn)方法建立階段對(duì)關(guān)鍵步驟開(kāi)展充分驗(yàn)證，以確保實(shí)驗(yàn)方法具備穩(wěn)健性。湖州申科研發(fā)的磁珠捕獲式 IMBS 技術(shù)（immunomagnetic beads separation，免疫磁珠分離），在開(kāi)發(fā)過(guò)程中已對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分驗(yàn)證，相關(guān)驗(yàn)證結(jié)果已通過(guò)專業(yè)評(píng)審，具體驗(yàn)證內(nèi)容（部分）如下：① 方法優(yōu)化：圍繞磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)開(kāi)展優(yōu)化驗(yàn)證，確保方法穩(wěn)健性；② 過(guò)程質(zhì)控：二維電泳存在實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、時(shí)間跨度大、中間環(huán)節(jié)難把控等問(wèn)題，因此在等電聚焦實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)引入熒光標(biāo)記多肽，可快速判定等電聚焦效果；同時(shí)在 SDS-PAGE 電泳兩側(cè)增設(shè) 40 ng 銀染質(zhì)控樣品，用于控制銀染顯色過(guò)程；③ 方法重復(fù)性：針對(duì) 2D 分析與 LC-MS 分析開(kāi)展重復(fù)性驗(yàn)證，其中 2D 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 80% 以上，LC-MS 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 90% 以上；④ 上樣量?jī)?yōu)化：針對(duì) 2D 分析與 LC-MS 分析實(shí)施上樣量驗(yàn)證，規(guī)避上樣量差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；⑤ 假陽(yáng)性排查：排查樣品與陰性抗體間是否存在非特異性結(jié)合，確認(rèn) IMBS 實(shí)驗(yàn)設(shè)定的步驟與參數(shù)是否會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

HEK293細(xì)胞源自人胚腎細(xì)胞，在細(xì)胞與基因治療領(lǐng)域應(yīng)用較廣，例如用于病毒載體生產(chǎn)等。盡管生物制品會(huì)經(jīng)過(guò)多步純化工藝去除相關(guān)雜質(zhì)，但微量殘留的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）仍可能引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量與安全性。因此，需對(duì)生產(chǎn)工藝中殘留的HEK293 HCP開(kāi)展定量檢測(cè)，確保其符合產(chǎn)品放行標(biāo)準(zhǔn)。湖州申科生物的HEK293 HCP殘留檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法），適用于對(duì)HEK293及HEK293T來(lái)源生物制品（如重組蛋白類、細(xì)胞和基因治療類等）中的宿主細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。該試劑盒檢測(cè)步驟少、速度快，且具備專一性強(qiáng)、性能穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。

為何定制化試劑盒是宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的優(yōu)先選擇？特定工藝來(lái)源的抗原與校準(zhǔn)品更具代表性，是重要原因之一。不同生物制品的上游生產(chǎn)工藝存在差異，比如培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、收獲時(shí)機(jī)等不同，都會(huì)使產(chǎn)生的 HCP 在蛋白種類、豐度及翻譯修飾上出現(xiàn)區(qū)別，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)入下游純化工藝的 HCP 類型相應(yīng)改變 —— 尤其是與藥物主成分共同純化的 HCP，會(huì)以優(yōu)勢(shì)蛋白的形式存在于藥物原液或制劑中。HCP 定制化 ELISA 檢測(cè)試劑盒通常選用實(shí)際生產(chǎn)工藝中上游發(fā)酵后的樣品制備抗原與校準(zhǔn)品，這樣制得的校準(zhǔn)品能較充分地體現(xiàn)實(shí)際工藝中的 HCP，有效降低因抗原或校準(zhǔn)品種類不足引發(fā)的漏檢風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)減少定量不準(zhǔn)確的問(wèn)題。